Штамм бактерий jersinia реsтis, используемый для контроля цепи синтеза l-аргинина на этапе образования l- аргининосукцината

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к генетике чумного микроба, и касается нового штамма бактерий JERSINIA PESTIS, который может быть использован в качестве эталонного объекта для контроля генетического повреждения гена L - аргининосукцинатсинтезы и изучения пути биосинтеза аргинина. Целью изобретения является получение безопасного в работе, авирулентного штамма чумного микроба JERSINIA PESTIS ВНИПЧИ "Микроб" Е 4 КМ - 224 ARG<SP POS="POST">-</SP> с генетическим повреждением гена, контролирующего синтез L - аргининосукцинатсинтетазы. При выращивании на среде М - 9 с добавлением L-метионина и L-фенилаланина, но без добавления предшественников синтеза аргинина и той же среде с цитруллином штамм не растет. На той же среде с добавлением L-аргининосукцината и L-аргинина штамм обнаруживает четкий рост.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4425859/13 (22) 12.05.88 (46) 07.07,91. Бюл. ¹ 25 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) В.E.Âàëåíöåâ, Б.Н.Мишанькин и В.Ю.Рыжков (53) 663.15(088.8) (56) Пашевина Г.О.,Стеканов B.М.,Пейсахис

Л.А., Быков Л.Г. Аргининзависимые возбудители чумы, выделенные в муюнкумах.—

Проблемы особо опасных инфекций, 1968, вып.2, с.173 — 175. Мартиневский И.Л., Хайдаров Т,Б., Хакимов М.М.,Ахмедов Э.Г., Варлимова Ж.Г. О выделении в Среднеазиатском пустынном очаге.аргининзависимых штаммов чумного микроба и их свойствах. Селекция и генетика возбудителей особо опасных инфекций,—

Саратов, 1982, с.77-79. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSlNIA PESTlS, ИСПОЛ6ЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЦЕПИ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к генетике чумного микроба, и касается нового штамма: бактерий Yerslnia pestls, который может бть использован в качестве эталонного объекта для контроля генетического повреждения гена L — аргининосукцинатсинтетазы и изучения . пути биосинтеза аргинина.

Цель изобретения — получение безопасного в работе, авирулентного штамма чумного микроба Yersinia pestls ВНИПЧИ

"Микроб" ЕУ КМ-224 arg с генетическим

„„Я2 „„1661207 А1 (51)5 С 12 N 1/20, 15/01//С 12 Q 1/00

СИНТЕЗА L-АРГИНИНА НА ЭТАПЕ ОБРАЗОВАНИЯ L-АРГИНИНОСУКЦИНАТА (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к генетике чумного микроба, и касается нового штамма бактерий Yersinia pestis, который может быть использован в качестве эталонного объекта для контроля генетического повреждения гена L-аргининосукцинатсинтетазы и изучения пути биосинтеза аргинина.

Целью изобретения является получение безопасного в работе, авирулентного штамма Чумного микроба Yersinia pestis ВНИПЧИ "Микроб" Е4 KM — 224 arg c генетическим повреждением гена, контролирующего синтез 1=аргининосукцинатсинтетазы. При выращивании на среде М-9 с добавлением L-метионина и L-фенилаланина, но без добавления предшественников синтеза аргинина и той же среде с цитруллином штамм не растет. На той же среде с добавлением L-аргининосукцината и L-аргинина штамм не обнаруживает четкий рост, повреждением гена, контролирующего синтез L-аргининосукцинатсинтетазы.

Штамм Yersinla pestls КМ-224 arg является производным вакционного штамма

ЕУ-76 линии НИИЭГ. Получен при помощи химического мутагенеза N-метил-N-нитроN íèòðîçîãóàíèäèíîì с последующей селекцией пенициллиновым способом.

Оптимальные условия хранения штамма: 1) в лиофилицированном состоянии при температуре от-20 до 4 С; 2) на скошенном агаре Хоттингера при периодических пересевах через 1,5 — 2 мес.

1661207

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

Полиморфные грамотрицательные па- 5 лочки (0,4х0,9 мкм). В мазках из бульонных культур встречаются биполярно окрашенные клетки; расположенные цепочкой. На поверхности агара Хоттингера (рН 7,1) культура штамма формирует колонии в P-форме 10 с типичной для чумного микроба морфологией. В бульоне культура штамма дает придонный агглютйнативный рост в виде хлопьев, среда при этом остается прозрачной. 15

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода.

Сбраживает с образованием кислоты без аза глюкозу, мальтозу, маннозу, маннит, :: алак азу, аоэбинозу и не сбраживает саха- 20 зозу, дульцит, сорбит, лактозу, рамнозу, : pицерин, Отношение к источникам азота. Используют аммоний::- ый и аминный азот в составе аминокислот рост возможен рН 25

4,5 — 8,5. Оптимальный рН 7,0 — 7,2. г1- Р6о С синтезирует пестицин, фиб.-инолизин и плазмокоагулазу, на среде с гемином образует непигментированные колонии; при 37 С синтезирует антиген — 30 фракцию i. При подкожном введении 1х10 микробных клеток EV KM-224 arg гибели лабораторных животных не вызывает.

Лизируется фагами: чумным диагностическим Л-413, Т-7 и Д.Эрреля. 35

Штамм Yersinla pestis EV KM-224 arg ауксотроф. Кроме L-аргининосукцината или

1=аргинина для своего роста и размножения при 28 С на синтетической среде М-9 нуждается в L-метионине и L-фенилаланине. 40

Особенностью является искусственно введенная в геном мутация, которая повреждает фермент превращения цитруллина в присутствии АТФ и аспартата в

1=аргининосукцинат-L-аргининосукцинатс- 45 интетазу. В фенотипе зто свойство проявляется ауксотрофностью по L-аргинину с возможностью замены последнего

L-аргининосукцинатом. На синтетических средах с необходимыми 1=метионином, 1= 50 фенилаланином, треонйном, L-цистеином и

L-аргининосукцинатом (натриевая или калиевая соли) при 28 С через 4-6 сут культура штамма образует светлые колонии размером до 1,5 мм. На средах без аргининосук- 55 цината, но содержащих цитруллин— непосоедственный предшественник синтеза =аргининосукцината, и аспартат, рост культуры штамма отсутствует при высевах от 1х10 до 1х10 клеток, Это свидетельст1 9 вует о том, что клетки штамма не способны осуществлять ферментативное превращение цитруллина до аргининосукцината.

Этот генетический признак стойко наследуется — уровень спонтанной реверсии к прототрофности по признаку не превышает

1х10 9, Штамм высокоспецифичен и не растет в присутствии L-форм других аминокислот.

Пример. Использование штамма У, pestis EV КМ-224 arg в качестве тест — штамма при контроле блока биосинтеза аргинина у природных (или индуцированных) аргининзависимых ауксотрофов с неизвестным уровнем генетического повреждения.

1, Подготовка и итател ьн ых сред. К остывающей питательной среде M-9 добавляют (из расчета на 1 л) стерильные растворы

10 -ного сульфата магния 10 мл, по 1 мл

1 -ного растворов аминокислот в L-форме (фенилаланина и метионина, треонина, цистеина, лейцина, изолейцина, тирозина, триптофана, глицина, валина). Группа контрольных сред(1-я группа) не содержит предшественников синтеза аргинина. В опытные среды вносят до 10 мкг/мл L-цитруллина (2-я группа). L-аргининосукцината (3-я группа) и L-аргинин (4-я группа).

2. Подготовка культур. Культуры Y.

pestis EV KM-224 arg и параллельно исследуемых штаммов выращивают на поверхности пластинок агэра Хоттингера (рН 7,1 — 7,2) в течение 24 — 48 ч при 28 С. Готовят бактериальные взвеси в забуференном физиологическом растворе (рН 7,1) плотностью

1х10 клеток на 1 мл и по 0,1 мл высевают на поверхность синтетических питательных сред. Посевы инкубируют при 28 С в течение 3 — 5 сут.

Предлагаемая в качестве тест-штамма культура Y.pestis EV КМ-224 arg на контрольной среде (1-я группа) и среде с цитруллином (2-я группа) не вырастает, так как ее клетки не могут осуществлять процесс обра-. зования (-аргининосукцината из цитруллина. В то же время на опытных средах с

L-аргининосукцинатом (3-я группа) и L-аргинином (4-я группа) штамм обнаруживает четкий рост.

Если исследуемые штаммы дают идентичный характер роста на питательных средах, т.е. вырастают на . средах с

L-аргининосукцинатом и L-аргинином, то можно сделать вывод о повреждении гена, контролирующего аргининосукцинатсинтетазу, В тех случаях, когда исследуемые штаммы, как и тест-штамм дают рост только на питательных средах с 1=аргинином (4-я группа), но не на средах с.предшественниками

1661207

Составитель Л. Минаева

Техред М.Моргентал . Корректор Э. Лончакова

Редактор Н. Яцола

Заказ 2097 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 (L-аргининосукцинатом, L-цитруллином) можно сделать заключение о том, что имеет место повреждение L-àðãèíèíîñóêöèíàòëèазы, осуществляющей превращение L-аргининосукцината в L- аргинин.

Предлагаемый штамм может быть использован как эталонный объект для контроля генетического повреждения гена

L-аргининосукцинатсинтетазы при сравнительном анализе индуцированных аргининзависимых мутантов вирулентных штвммов или выделенных в природных очагах чумы, а также может служить в качестве тестштамма для контроля ростовых свойств питательных сред (как полных так и

5 синтетических) при работах со штаммами возбудителя чумы.

Формула изобретения

Штамм бактерий Yersinia pestls ВНИПЧИ "Микроб" ЕУ КМ-224 arg, используемый

10 для контроля цепи синтеза L-аргинина на этапе образования 1=аргининосукцината.