Способ отбора мутантов sтrертомyсеs sрнеrоidеs - продуцентов экзопротеазы с фибринолитической активностью

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение отбора и повышение выхода ферментов , Способ заключается в том, что споры Streptomyces spheroides штамм № 35 обрабатывают Ультрафиолетовым светом и высевают на агаризованную среду, содержащую экзопротеазы S.spheroides с фибринолитической активностью в концентрации 5-15 мг/мл. с S

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (И) {5))5 С 12 N 15/01, 9/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к двтоесиоию свидятельству

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ . ПРИ ГКНТ СССР (21) 4698179/1 3 (22) 30.03.89 (46) 28.02.91. Бюл. Р 8 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) M.A.Àëü-Нури и Н.И.Прянишникова (53) 575.224.4.08(088 ° 8) (56) Авторское свидетельство СССР

М- 973609, кл. С 12 D 13/ 10, 1982.

Прянишникова Н,И. Мутанты S.sphегоides штамм N 35 — активного продуцента протеиназ с фибринолитическим действием. — Микробиология и научнотехнический прогресс. — Киев: 1983, с. 125.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ, может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, а также в селекции и биохимии.

Цель изобретения — упрощение отбора и повышение выхода фермента.

Штамм Streptomyces sphегоides .Ni 35 культивируют после обработки ультрафиолетовыми .лучами на средах с высокими концентрациями собственного протеолитического экзофермента, предварительно выделенного из культуральной жидкости продуцента.

Способ быстрого получения мутантов-сверхсинтетиков экзопротеаз основан на явлении подавлейия роста. спор исходного штамма собственным экзо.ферментом, Выделение мутантов, выра2 (54) СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТОВ БТККР--70HYCES SPHегоIDF S — ПРО ЦУЦЕН ТОВ

ЭКЗОПРОТЕАЗ1! С ьИБРИНОЛИТИЧЕСКОИ

АКТИВЦОСТЫ) (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ. Цель изобретения — упрощение отбора и повышение выхода ферментов. Способ заключается в том, что споры Streptotnyces sphегоides штамм - 35 o6pa6aòêsàþò )ультрафиолетовым светом и высевают на агаризованную среду, содержащую экзопротеазы S.sphегоides с фибринолитической активностью в концентрации 5-15 мг/мл.

1 стающих в условиях присутствия в среде высоких концентраций собственного фермента, добавленного в среду извне, т.е. в условиях полного подавления роста исходного штамма, позволяет из малого числа отобранных колоний получать продуценты с очень высокой протеолитической активностью фибринолитических протеаз.

Пример 1. Культуру штамма

Str.sphегоides N - 35 выращивают в синтетических средах в аэробных условиях при 28 С на круговой качалке с 200220 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл. Из культуральной жидкости высаливанием сернокислым аммонием при 90% от полного насыщения после выдерживания в течение 24 ч при +3 С центрифугированием при

10 тыа. об/мин выделяют протеолитический ферментный комплекс, который

1631082

40 гомогенизируют н минимальном объеме буфера трис-НС1, рН 7,5, и подвергают диализу в течение 24 ч против этого же буфера, Полученный ферментный раствор (концентрации 10 мг/мл по белку), вносят в стерильные металлические из нержавеющей стали объемом

1 см цилиндры, стоящие на поверхности твердой среды для выращивания стрептомицетов, уже густо засеянные моноспороной суспензией спор, содержащей 2 10 -2.10 спор стрептомицета

7 8 в 1 мл фосфатного буфера 0,005 М, рН 7, подвергшейся предварительно облучению УФ-лучами н оптимальной для получения "+" вариантов дозе.

Через 5 дней инкубации просматривают засеянные чашки Петри (среду в чашках

Петри приготавливают с агаром в кочцентрации 1Х, что обеспечивает лучшую диффузию фрагмента н агар, а посев густым газоном исключает стадию подбора концентраций высеваемых на чашки Петри суспензий, необходимую при рассеве на фибриновые среды что значительно упрощает селекционную работу) ° Зона подавления роста стрептомицета при этом составляет 30-40 мм ,вокруг цилиндров с ферментом, и толь- . ко единичные колонии все же вырастают в этом пространстве. Зти колонии ,отбирают и пуоверяют их способность ( к образованию экзопротеаз с фибринолитическим действием. Мутанты выращивают на синтетических средах со стадией предварительного инокулирования.

Пример 2, Культуру штамма

Str.sphегоides Р 35 выращивают на синтетических средах в аэробных условиях при 28 С на круговой качалке с 220-200 об/мин в колбах на

750 мл с объемом среды 100 мл. Из культуральной жидкости высаливанием

45 сернокислым аммонием при 907 от пол-. ного насыщения, после выдерживания в течение 24 ч при +3 С центрифугированием при 10 тыс.об/мин, выделяют протеолитический ферментный комплекс, который гомогенизируют в минимальном объеме буфера трис-НС1, рН 7,5, и подвергают диализу в течение 24 ч, против этого же буфера.

Полученный ферментный раствор в кон- центрации 15 мг/кг по белку вносят 55 в стерильные цилиндры из нержавеющей стали, стоящие на поверхности твердой среды. Далее операции аналогичны примеру 1. Зона подавления роста стрептомицета при этом составляет 3040 мин вокруг цилиндров.

Единичные колонии, выросшие в этой зоне, отбирают и проверяют их фибринолитическую активность.

Пример 3. Культуру штамма

Str.sphегоides Р 35 выращивают на синтетических средах в аэробных условиях при 28 С на круговой качалке с 200-220 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл; Из культуральной жидкости методом, аналогичным примеру 1 и 2, выделяют протеолитический ферментный комплекс. Полученный ферментный раствор вносят в стерильные металлические цилиндры из нержавеющей стали в концентрации

5 мг/мл по белку. Дальнейшие операции с опорами стрептомицета аналогичны примеру 1 и 2. Диаметр зоны подав,ления роста культуры на чашках Петри составляет 15-20 мм вокруг цилиндров с ферментом. Так как зона мала, то выросшие колонии из нее практически отобрать невозможно.

Таким образом, оптимальная концентрация вносимого ферментного раст-, вора составляет 10 мг/мл, увеличение концентрации ферментного раствора до.15 мг/мл, связанное с большим расходом фермента, не дает увеличения зоны подавления роста, уменьшение же концентрации до 5 мг/мл ведет к значительному уменьшению величины диаметра зоны подавления роста, что делает отбор невозможным. Формула изобретения

Способ отбора мутантов Streptoшусез sphегоides — продуцентов экзог.ðoòeàçû с фибринолитической активностью, предусматривающий обработку штамма S.sphегоides Р 35 ультрафиолетовым светом с последующим высевом спор на селективную среду, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения отбора и повышения выхода фермента, споры высенают на среду, содержащую экзопротеазу из Ь .sphегоides в концентрации 5-15 мг/мл.