Способ селекции слабовирулентных клонов листерий

 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, связано с получением авирулентных штаммов листерий. Целью изобретения является снижение вирулентных клонов за более короткий срок. Способ заключается в том, что методом селекции на средах с антибиотиками получают клоны, устойчивые одновременно к стрептомицину (100 мкг/мл) и канамицину (50 мкг/мл), отбирают клоны, клетки которых превышают длину клеток исходного штамма в 2-3 раза, и определяют их вирулентные свойства. 2 та бл. с SS

СООТГ ССВЕТСНИХ

° Н

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 И 15/01

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Il0 ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, Ф юВ

O

h".

К А В1 ОРСНОМЪГ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4681599/13 (22) 18.04.89 (46) 07.04,91. Бюл. Ф 13 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (72 ) И.А. Бакулов, Н. Б. Бак алдина, В.M.Êoòëÿðoâ, В.Е. Белоусов и Ю. В. Числов (53) 575. 12 (088. 8) (56) Fensterbank. R. Selection et

caracterisation d une souche vaccinale йе Listeria monocytogenes hypovirulente pour 1а soris. — В кн, Lisaerise, Listeria, Listeriosis./Под ред. А.L. Cour tieu, Е. P. Espaxe.

А. E. Reynand, 1985, р. 209-217.

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, связано с получением авирулентных штаммов листерий для создания средств специфической профилактики листериоза и может быть использовано в научноисследовательских и производственныхх лабораториях, занимающихся проблемой листериоза.

Целью изобретения является снижение вирулентности клонов за более короткий срок.

Способ заключается в применении в качестве селективиых факторов антибиотиков стрептомицина и канамицина с последующим направленным отбором слабовирулентных клонов по морфоло.гическим признакам клеток при микроско„„Я0„„164О162 A 1

2 (54) СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ СЛАБОВИРУЛЕНТНЫХ КЛОНОВ ЛИСТЕРИИ (57) Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, связано с получением авирулентных штаммов листерий. Целью изобретения является снижение вирулентных клонов за более короткий срок. Способ заключается в том, что методом селекции на средах с антибиотиками получают клоны, устойчивые одновременно к стрептомицину (100 мкг/мл) и канамицину (50 мкг/мл), отбирают клоны, клетки которых превышают длину клеток исходного штамма в 2-3 раза, и определяют их вирулентные свойства.

2 табл. пировании, что приводит к 1000-кратному и более снижению вирулентности за счет нового сочетания антибиотиков, а также позволяет избежать испытания на животных вирулентных свойств всех полученных антибиотикоустойчивых мутантов, что сокращает время и материальные затраты на их получение и выявление.

Пример. Рабочие растворы стрептомицина и канамицина в ФСБ (фосфатносолевом буферном растворе рН 7,2-7,4) готовят в количестве

3,0 мл каждый с концентрацией 5 мг/мл.

Растворы антибиотиков стерилиэуют фильтрованием через фильтры с размером пор 0,22 мкм и хранят до применения в

3 1640162 4 замороженном состоянии при (-20)(+1) С.

Бульон и.- агар ВН1 готовят по имеющимся прописям к соответствующим сре5 дам. Аг.ар ВН1 разливают в чашки Петри диаметром 100 мм по 20 + 2 мл.

Приготовление антибиотикосодержащего бульона ВН1 проводят добавлением необходимого объема рабочего раствора 10 антибиотика к стандартному бульону непосредственно перед посевом листер ии °

Антибиотикосодержащий агар ВН1 готовят за 1 сут до применения. Для этого к 100 мл расплавленного остуженного до 45-50 С агара ВН1 добавляо ют необходимое количество рабочих сте» рильных растворов антибиотиков, тщательно перемешивают и разливают в сте-20 рильные чашки Петри (диаметром 100 мм) по 20+2 мл и хранят при 4 + 1 С до б применения.

Клетки штаммов L. monocytogenes 766 (1а серовар) и 1196 (4Ь серовар) выращивают в течение 18+2 ч в 5 мл среды ВН1 при 37+2 С,.затем осаждают их

10-минутным центрифугированием при

6000g, ресуспендируют в 0,5 мл стерильного физиологического раствора и равномерно распределяют по поверхности агара ÂÍ1 в чалках Петри. Через 2030 мин в центр чашки наносят 20 мкл раствора стрептомицина, т.е. 100 мкг антибиотика. Чашки инкубируют при

37+2 С в течение 20-24 ч. Выросшие в о 35 зоне накапывания стрептомицина колонии, устойчивые к данному антибиотику, отбирают стерильной петлей, высевают в 5 мл бульона ВН1, содержащего

100 мкг/мл стрептомицина, и выращивают в течение 18-20 ч при 37+2 С.

Затем клетки осаждают 10-минутным центрифугированием при 6000g, ресуспендируют B 0,5 mr ФСВ раствора и 45 равномерно распределяют по поверх ности агара ВН1,содержащего 100 мкг/мл стрентомицииа. Через 20-30 мин в .:центр чашки с агаром накапывают

4 мкл раствора канамицина (20 мкг), по.сле чего чашки инкубируют при

37+2 С 18-20 ч.

Выросшие в зоне накапывания канамицина колонии высевают в 5 мл ВН1 бульона, содержащего 100 мкг/мл .стрептомицина и 20 мкг/мл канамицина.

Описанную операцию повторяют еще раз, повьппая концентрацию канамицина, до 50 мкг/мл. Колонии, выросшие на агаре ВН1, содержащем 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина,, изучают под микроскопом и определяют размер (длину) клеток по известному методу. Мутантные стрептомицин-канамицинустойчивые клетки длиной 2-4 мкм отбирают и определяют их пятидесятипроЦентную- летательную дозу (ЛД >) при внутрибрюшинном заражении мьппей.

Соответствие размера клеток (длины) и их вирулентных свойств (JQgo) приведены в табл. f и 2. Результаты про-. веденных исследований приведены в таблицах 1 и 2. Связь вирулентных свойств (ЛД, ) и размера (длины) мутантных стрептомицин-канамицинустойчивых клеток листерий приведена в табл. 1.

Как видно из табл. 1, установлена зависимость между размером клеток и вирулентными свойствами мутантных антибиотикоустойчивых штаммов: клетки слабовирулентных мутантных клонов в

2-3 раза превышают размер клеток ис- ходного вирулентного штамма.

Влияние сочетания антибиотиков стрептомицина и канамицина на вирулентные свойства мутантных штаммов листерий приведено в табл. 2.

Таким образом, результатами исследований показано, что используя сочетание антибиотиков стрептомицина и канамицина в концентрации 100 и

50 мкг/мл соответственно, а также направленный отбор слабовирулентных мутантных клонов in vitro микроскопией по размеру клеток, можно без больших затрат в более короткий срок получить клоны листерий с 1000-кратно ослабленной вирулетностью.

Формула изобре тения . Способ селекции слабовирулентных клонов листерий, включающий выращивание биомассы исходного. штамма. высев ее на содержащие антибиотик среды, выделение антибио тикоустойчивых мутан1 тов и отбор слабовирулентных клонов,о т" л и ч а ю шийся тем, что, с целью снижения вирулентности клонов за более короткий срок, биомассу исходного штамма выращивают на среде, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина и

50 мкг/мл канамицина, а отбор клонов проводят по размеру клеток, при этом длина отобранных клеток должна превы,,шать длину клеток исходного вирулент ного штамма в 2-3 раза.

1640162

Т а б л и ц а 1

L. monocyto- Размер клеток Показатель

genes 766 (длина), мкм достоверности, P

Вирулентность при внутрибрюшинном заражении мышей ЛД50

1,0х10 (О, 01

1,1 «0,1

Т а блиц а2

Штамм 1.mono-.

cytogenes

Фе но типиче сВирулентно сть кая характеристика штамма при внутрибрюшинном заражении мышей, Лд ) 766

Исходный

1,0х10

8эЗх)0

2,3х10

1,7х10

Stm5 щ

Stm" 100.

Km" 50

Stma 100

Km 50

Мутанты

1 196

Исходный

Мутанты

Stm йл з

Stmg 100

Km" 50

3,8х10

4,0х108

П р и м е ч а н и е S — чувствительноо сть к ан ти био тику, R — устойчивость к антибиотику;

Stm — стрептомнцин;:

Km — канамицин;

100 и 50- концентрация данного анти-. биотика, мкг/мл.

Исходный

Мутантные стре птомицин-к анамицинустойчи вые клоны

2

4

6

2 5+0 3

1,8+0,2

1 8+0,3

2,0+0,3

2,0+0,2

1,9+0,2

2,5+0,3

1,9+0,2

à0,01 с0, 01

<О, 01 с .О, 05 (О, 01 а0,01

<О, 01 0,01

1,5х10

6,0х10

8,3х10

1,5z10

7.

1,1х10

1,2х107

1,1х10

9,5xt0