Способ идентификации в-лимфоцитов кур

 

Изобретение относится к ветеринарии , в частности к способу оценки иммунитета птиц. Цель изобретения - повышение производительности . способа и наглядности. Для этого из крови выделяют суспензию лимфоцитов4 проводят их электрофорез в геле, окрашивание фракций щелочной фосфотазы, после чего проводят идентификацию В-лимфоцитов по окрашенной медленной фракции изофермента щелочной фосфатазы. Учет результатов ведут по балльной оценке интенсивности окрашивания .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

КСПУБЛИН щ) .G 01 N 33/48!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 468787 7/13 (22) 04 .05.89 (46) 15.10.91. Бюл. М 38 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства (72) А.Ф..Хлопина, Н.Д. Придыбайло и И,В. Белкина (53) 612.42 (088.8) (56) Лойда Т.,Госстрау P., кеплер Т.

|Гистохимия ферментов, M.: Мир, 1981, с. 6 I. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ В-ЛИИФОЦИТОВ КУР

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу оценки иммунитета птиц, и может быть Использовано в ветеринарной клинической диагностике для оценки активности пролиферирующих клеток продуцентов антител.

Целью изобретения является повышение производительности способа и наглядности.

Способ осуществляется следующим образом.

Для выделения лимфоцитов кур берут в орошенную гепарином пробирку кровь в объеме до 2 мп, наслаивают на фикол-урографиновый градиент (d

1,082) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 350g в течение 40 мин.

Лимфоциты отбирают иэ интерфаэы, трижды отмывают средой 199. Осадок

t лиифоцитов сохраняют прн температуо р -20 С.

„„SU„„1684673 Д 1

2 (57) Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу оценки иммунитета птиц. Цель изобретения — повышение производительности . способа и наглядности. Для этого иэ крови выделяют суспензию лимфоцитов проводят кх электрофореэ в геле, окрашивание фракций щелочной фосфотазы, после чего проводят идентификацию В-лимфоцитов по окрашенной медленной фракции иэофермента щелочной фосфатаэы. Учет результатов ведут по балльной оценке интенсивности окрашивания.

Для проведения электрофореза к

0,05 мл осадка лимфоцитов добавляют равный объем среды следующего соста-, ва: 60Х сахарозы, 1Х тритона Х-100, 1 кристалл бромкрезолового красного,, и выдерживают 5-10 мин при комнатной температуре. Затем образцы лимфоцитов наносят на столбики с 4Х концент- р, рацией акриламида на трис-НС1 буфере (рН 6,7) с добавлением 1Х тритона

Х-100 и разделяющего геля с 9Х-ной концентрацией акриламида на трис-НС1, буфере рН 9,6 с добавлением 1Х тритона X-100.

Разделение белковых молекул проводят 240 мин. При силе тока 2-3 мА/

/трубку в электродном буфере рН 8,6 следующего состава: 1,2 r .гидрооки- си лития; 11,8 г борной кислоты, 2Îä0 ип дистиллированной воды.

По окончании электрофореза для окрашивания образцов гели извлекают

16846 73 из трубочек и переносят в кювету с инкубационной средой следующего состава: 5 0 мг нафтол-As-ИХ-фосфат;

0,25 мл диметилсульфоксид; 25 мл вероналацетатного буфера рН 9,2;

25 мг прочного синего ББ.

Гели инкубируют с сыворотками крови в течение 20 мин при 37 С с образцами лимфоцитов в течение 24 ч в холодильнике.

Учет результатов проводят визуально. Иаксимальная интенсивность окрашивания обозначается как "++> и далее по степени снижения интенсив:—

Hocти выражаит как ++ + и ОTcpT—

cTBzip. окрашенной zIz лосы отмечается

II н

Пример 1, Идентификпг;ьгя по медленному изоферме»ту щелочной фос4 о- 0 тазы В-лимфоцитов.

Готовят суспен.гггю лимфоцитов !5-дневных цыпггят следующим обра;о"1 . кровь с гегарином в объеме до 2 мл наслаивают на фикол-упрографиловый градиент (d = 1,082) в соотношении

?: 1 и ц:=.нтрифугируют при 3508 40 мин, иг:фон»tol трижды пр эггывают средой о 99, с .хр;»лют при температуре -20 С. атсм:. 50 мкл осадка лимфоциzов Лобавля гт разный об е среды, содержащей 6i) сахарггзы, 1, тритона Х-100

1 кристалл бромкрезолового красного.

Через 5-10 мигг «а»асят на столбики

4 конце»трир ",,я!ге«о геля (трис — НС1, . рН 6,7, с добавлением 1 тритона

Х-100) и 9. -. разделяюгяего геля (трисНС1, рН 9,6„с добавлением 1 тритона Х-100) ., Разделение белковых молекул прово дят 240 мин при силе тока 2 — 3 мА/труб-4 ку в электродном буфере гидроокись— лития — борная кислота (соответственно 1,2 г и 11,8 r на ?000 мл воды) рН 8,6.

После окончания электрофореза гель извлекагот и окрашивают 24 ч лрн 4 С в среде, содержащей 5 0 мг нафтол-As-ÌÕ-фосфат; О,?5 мл диметип-. ульфоксггд, 25 мл веронал-е цетатного буфера, рН 9,2; 25 мг прочного синео ББ. Гель сохранялся в 7 -ном растворе уксусной кислоты„

Для получения электрофореграммы щелочной фосфотазы сыворотки крови з5 поступают следующим с бра зом. Кровь в объеме 1 мл после отслаивания сгустка центрифугирукгт 15 мин при 350g, затеи к 50 ",;.-л добавляют равный обьем среды следующего состава: 60 сахарозы, 1 тритона Х-100, 1 кристалл бэомкрезолового красного. Далее через 5-10 мин наносят на столбики с г лем и т.д. аналогично описанного в гше.

После окрашивания оба столбика с гелем анализируют и наблюдают наличие линии спектра синего цвета с одинаковой подвижностью. Следовательно, медленный изофермент щелочной фосфатаэы спектра сыворотки крови соответствует очищенным В-лимфоцитам цыплят.

В пробе сыворотки крови дополнительно наблюдалась быстрая фракция щелочной фосфатазы.

П р и и е р 2. Влияние ингибитора бурсы циклофосфана на спектр щелочной фосфатазы сыворотки крови.

Суточным цыплятам в течение трех дней вводят циклофосфан (ингибитор бурсы) в дозе 60 мг/кг. В возрасте

6 дней исследуют электрофореграмму лимфоцитов переферической крови.

С этой целью кровь с гепарином в объеме до 2 мл оерут от контрольных и опытных цыплят, наслаивают на фикол-урографиновый градиент (d = 1,082) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 3508 40 мин. Затем трижды промывают срецой 199 и сохраняют при необходимости при температуре -20 С. о

Затем к 50 мкгг осадка лимфоцитов добавлякт равный объем среды, содержащей

E()/ сахаровы, 17, тритона ... и т.д., аналогично описанного в примере 1.

После окрашивания анализируют столбики гелей контрольной и опытной групп. В контроле получают аналогично примеру 1,окрашенную синюю полосу, а в опытных столбиках — либо следы от соответствующих линий в контроле, либо вовсе отсутствие окраски.

Tc zèì образом, иммунодефицит В-лимф гцитGB вызванный циклофосфаном, регистрируется при цитохими".оком нрав яггггагггпг электрофорегр;гмм из проб JIHH фоцитов крови птиц.

Способ является микрометодом, так как достаточно 50 мкл исследуемого

b атериала (лимфоциты, сыворотка кроги)„ Способ позволяет откалиброьать к»те»с»в»ость слабовыраженного изо4ермента .,"" ) как соответствуюггеге

0,5 мкг;.елка> не требует наличия спец»фи гес ких антисывороток » посв

168

Составитель M. Малярова

Редактор В. Трубченко Техред Л.Сердюкова Корректор А. Обручар

Заказ 3502 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 тановки опыта в день взятия крови, окрашивание мажет быть проведено сроком до 8 дней, доступен для интерпретации результатов сразу после цитохими еского окрашивания.

Производительность способа ограничена лишь конструкцией аппарата для проведения электрофореэа (14-24 столбиков с гелем), тогда как при технике микроскопирования в день можно сделать заключение о 10-12 мазках в день.

Способ имеет безусловное преимущество в иллюстративности материала и позволяет быстро и наглядно оценить состояние В-иммунитета птиц.

4Ь73

6 формула изобретения

Способ идентификации В-лимфоцитоз кур, включающий получение пробы

5 крови, окрашивание лимфоцитов на щелочную фосфатаэу и учет результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения проиэнодитель10 ности и наглядности способа, иэ крови выделяют суспензию лимфоцитов, проводят злектрофорез в геле и идентификацию В-лимфоцитов ведут по окрашенной медленной фракции изоферме..— та щелочной фосфатазы, а учет разул в татов осуществляют по балльной оценке интенсивности окрашивания .