Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкозно-фруктозного сиропа. Цель изобретения - повышение активности препарата иммобилизованной глюкозоизомеразы и упрощение процесса. Способ заключается в иммобилизации внутриклеточной глюкозоизомеразы , выделенной из Streptomyces rublginosus на фенолформальдегидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см3/г с алифатическими аминогруппами в количестве 4,6-8,3 мг-экв/r при соотношении фермент: носитель 2100-2200 ЕД на 1 г носителя, причем для дополнительного повышения активности при иммобилизации вводят сернокислый магний в концентрации 5ИО - 10 М. Способ позволяет увеличить активность целевого продукта в 1,5-2 раза, а также упростить процесс. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. ё

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 11/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

4 t

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ " ;. :К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (О (л)

О (Л

О (21) 4726602/13 (22) 28.07.89 (46) 23.11.91. Бюл. N 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) В. А. Вакуленко, И. И. Меняйлова, Л. А.

Нахапетян, Л. И. Стрельникова и И. М. СтарКОВа (53) 577.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

М 1125248, кл. С 12 N 11/00, 1984.

2. Antrim R. Z., Auterinen А.-Z,А new

regenerable immobilized glucose isomегоse. — Starch/Starke, 1986, ч. 33, М 4. р. 132-136. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкоэофруктозных сиропов из крахмалсодержащего сырья.

Известен способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы путем сшивания биомассы продуцента глюкоэоизомеразы, предварительно обработанной поверхностно-активными веществами, глутаровым альдегидом (1).

Однако из-за недоступности внутриклеточного фермента для субстрата активность иммобилизованной глюкозоизомеразы невысока и составляет 245-278 ЕД/г препарата.

„„Я „„1693050 А1 ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкозно-фруктоэного сиропа. Цель изобретения — повышение активности препарата иммобилиэованной глюкозоизомеразы и упрощение процесса. Способ заключается в иммобилизации внутриклеточной глюкозоиэомеразы, выделенной из Streptomyces

rubiginosus на фенолформальдегидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см /г с алифа3 тическими аминогруппами в количестве

4,6-8,3 мг-экв/г при соотношении фермент: носитель 2100-2200 ЕД на 1 r носителя, причем для дополнительного повышения активности и ри иммобилизации вводят сернокислый магний в концентрации 5.10 — 10 М. Способ позволяет увеличить активность целевого продукта в i,5-2 раза, а также упростить процесс. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной глюкоэоизомеразы путем культивирования микроорганизмов

Streptomyces rubiginosus с внутриклеточной глюкоэоизомеразой, выделения внутриклеточного фермента, ул ьтрафил ьтрации, кристаллизации, повторного растворения фермента и иммобилизации его на предварительно гидратированном носителе, содержащем ДЭАЭ-целлюлозу, полистирол и оксид титана. Активность получаемого иммобилизованного препарата составляет в среднем 850 ЕД/г (2).

Недостатками известного способа являются недостаточно высокая активность препарата и многостадийность процесса, 1693050

Цель изобретения — повышение активности препарата иммобилизованной глюкозоизомеразы и упрощение процесса.

При предлагаемом способе культивируют микроорганизмы Streptomyces

rubiginosus внутриклеточной глюкозоизомеразой, выделяют внутриклеточный фермент, проводят ультрафильтрацию и затем осуществляют иммобилизацию глюкозоизомеразы на фенолформальдегидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см /г с алифатическими аминогруппами в количестве 4,6-8,3 мг-экв/г, причем в процессе иммобилизации вместе с глюкозоизомеразой к носителю может быть добавлен сернокислый магний.

Способ позволяет повысить активность иммобилизованной глюкозоизомеразы в

1,5-2 раза, а при иммобилизации в присутствии сернокислого магния активность дополнительно возрастает на 18-20 . Кроме того, исключаются стадии кристаллизации, повторного растворения фермента, а также предварительная гидратация носителя, что уп роща ет и роцесс.

Пример 1. Культивирование продуцента глюкозоизомеразы Streptomyces

rubiginosus АТСС 21175 проводят в ферментере емкостью 10 л при коффициенте заполнения 0,5. Для ферментера готовят 5 л питательной среды, для чего в ферментер заливают 4 л воды, загружают 0,15 кг глюкозы, 0,08 кг кукурузного экстракта, 0,004 кг аммония фосфорнокислого двузамещенного, 0,003 кг марганца сернокислого, 0,001 кг пеногасителя, объем доводят до 5 л водой, Смесь перемешивают до полного растворения компонентов и стерилизуют при 125 С в течение 40 мин, после стерилизации доводят рН до 6,3 аммиаком, Вносят посевной материал в количестве 0,5 л и начинают культивирование продуцента при 30 С и расходе воздуха 0,65 м на 1 м среды в 1 з мин, Через 20 ч, когда содержание глюкозы в среде достигнет уровня 10 г/л, проводят подпитку 0,5 л 60 (,-ного стерильного раствора глюкозы. К концу ферментации через

80 ч после инокуляции величина активности внутриклеточного фермента достигает 50

ЕД/мл. Культуральную жидкость в количестве 5 л центрифугируют при охлаждении, при этом получают 3,0 кг биомассы с влажностью 90 . К биомассе прибавляют 3,0 л

10 М раствора сернокислого магния, охлаждают смесь в ледяной бане. Разрушение биомассы ультразвуком осуществляют s течение 1,5-2 мин (частота ультразвука 22 кГц).

Активность глюкозоизомераэы после разрушения клеток и выхода фермента в раствор составляет 380 ЕД/мл суспензии, Разрушенную биомассу центрифугируют при охлаждении. Внутриклеточная глюкозоизомераза, освобожденная из клеток, остается в надосадочной жидкости, количество которой составляет 4,5 л. активность глюкозоизомеразы в растворе 85 ЕД/мл. После ультрафильтрации активность глюкозоизо меразы в ультраконцентрате составляет 800

ЕД/мл, общее количество ультраконцентра10 та 0,4 л. К 0,4 л ультраконцентрата добавляют 0,15 кг фенолформальдегидного носителя пористостью (1,2 см /г с алифатическими аминогруппами, количество аминогрупп 4,6 мг-экв/г), Иммобилизацию глюкозоизомеразы на носителе продолжа15 ют в течение 20 ч при 4-6 С при соотношеТаким образом, использование предложенного способа позволяет увеличить активность целевого продукта в 1,5-2 раза {от

670-900 до 1600-1900 ЕД/г), а также упростить процесс за счет исключения ряда стадий. Введение ионов магния в процессе иммобилизации приводит к дополнительному увеличению активности на 18-20 . нии фермента и носителя 2100 ЕД на 1 г, Активность полученного имобилизованного препарата составляет 1600 ЕД/г.

20 Пример 2. Процесс осуществляют по примеру 1 с той разницей, что используют штамм СЗ, а при иммобилизации к раствору фермента предварительно добавляют сернокислый магний в количестве 5 10 М. при

25 этом активность составляет 1650 ЕД/г препарата. Пористость носителя 1,1 см /г, количество аминогрупп 6,8 мг-экв/г, а соотношение фермент: носитель 2160 ЕД на

1 r носителя.

30 Пример 3. Способ осуществляют, как описано в примере 2, добавляя сернокиалый магний в количестве 1,0 " М. Пористость носителя 1,3 см"/г, количество аминогрупп 8,3 мг-экв/г, а соотношение

35 фермент: носитель 2200 ЕД на 1 г носителя.

Активность целевого продукта 1900 ЕД/r.

Использование концентрации сернокислого магния меньше чем 5 10 М не дает эффекта. а увеличение концентрации выше

40 10 M не приводит к дальнейшему увеличению активности иммобилизованного препарата.

В таблице 1 показано, как влияют пористость носителя и количество аминогрупп в

45 нем на активность целевого продукта. Из о этих данных следует, что при предложенном способе могут быть использованы носители с пористостью 1,1-1,3 см /г при содержании аминогруппы 4,6-8,3 мг-экв/г носителя, Со50 отношение фермент; носитель может варьировать от 2100 до 2200 Ед на 1 r носителя.

1693050

Составитель И.Привалова

Редактор О. Ю рковецкая Техред М. Моргентал Корректор О.Кундрик

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилиэованной глюкозоизомеразы, включающий культивирование продуцента Streptomyces

rubiginosus, отделение клеток, их разруше- 5 ние, выделение глюкозоизомераэы, ультрафильтрацию и ее иммобилиэацию на нерастворимом носителе, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности препарата иммобилизованной глюкозоизо- 10 мераэы и упрощения процесса, в качестве носителя используют фенолформальдегидный носитель с пористостью 1,1-1,2 см /г, з содержащий алифатические аминогруппы в количестве 4,6-8,3 мг-эквl г.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что при иммобилизации к ультраконцентрату глюкозоизомеразы добавляют сернокислый магний в количестве 5-10

-3

10-2 M.