Способ получения иммобилизованных клеток животного происхождения

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу инкапсулирования живых клеток в полые капсулы с полупроницаемыми оболочками. Цель изобретения - упрощение процесса и увеличение стабильности целевого продукта за счет повышения прочности оболочек полых капсул. Способ заключается в иммобилизации клеток животного происхождения в кольце капсулы прочности путем формирования оболочек капсул толщиной от 20 до 250 мкм из альгината кальция на поверхности самопроизвольно растворяющихся временных матриц. В качестве временных матриц используют капли водных растворов вязких веществ (вязкость 2 - 10 сП), таких как желатин, декстран и др. и изотонического раствора хлорида кальция с суспендированными в них клетками, капли разбрызгивают в водный раствор 1 - 4%-ного альгината натрия. Толщина стенок капсул зависит от времени экспозиции временных матриц в растворе альгината натрия. В случае поверхностно-зависимых клеток в суспензию клеток вводят микроносители, обеспечивающие их рост. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (gI)g С 12 N 11/00, 11/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4492687/13 (22} 11. 10:88 ! (46) 30.07.91. Бюп. Ф 28 (71) Научноисследовательский инсти тут биомедицинской технологии (72) М.А.Завальный, Н.А.Шубина и Б.Б.Егоров (53) 577.15(088.8) (56) Sefton И, . et аl. Microencapsulation of mamalian сеllз in à water-insoluble polyacrylate by coextrustion and interfacial precipitation. — Biotechnol. Bioeng. 1987, v. 29, р. 1135 — 1143.

Maftheus F.À. et аl. Optimization of microencapsulation parametrs: semipermeable microcapsules

as à bioartifical pancreas. — В1оtechnol. Bioeng., 1985, ч. 27, р. 146 — 150-. ! (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАН

НЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО ПРОИСХОМДЕНИЯ (57) Изобретение относится к биотех нологии, в частности к усовершенст= вованному способу инкапсулирования

Изобретение относится к биотехно логик, в частности к способу инкапсулирования живых клеток в полые капсулы с полупроницаемыми оболочка ьк, который может найти применение в медицине.

Цель изобретения - упрощение про цесса и увеличение стабильности целе » вого продукта за счет повышения прочности оболочек полых капсул.

„,Я0„„1666535 А 1 живых клеток в полые капсулы с полу проницаемыми оболочками. Цель изоб ретения упрощение процесса и уве личение стабильности целевого продукта за счет повышения прочности оболо чек полых капсул. Способ заключается в иммобилизации клеток животного происхождения в кольце капсулы проч= ности путем формирования оболочек кап= сул толщиной от 20 до 250 мкм из альгината кальция на поверхности самопроизвольно растворяющихся вре менных матриц. В качестве временных матриц используют капли водных раст воров вязких веществ (вязкость 210 сП), таких как желатин, декстран а

Ф и др., и изотонического раствора хлорида кальция с суспендированными в них клетками, капли разбрызгивают в водный раствор 1=4Жного альгината натрия. Толщина стенок капсул зави сит от времени экспозиции временных матриц в раств6ре альгината натрия.

В случае поверхностно зависимых кле= ток в суспензию клеток вводят микро- ( носители, обеспечивающие их рост. ©, Способ предусматривает включение клеток животного происхождения во временную матрицу гранулы альгината кальция, формирование водонераст воримой оболочки на поверхности вре= менной матрицы с последующим раство= рением временной матрицы и образова= нием полссти капсулы. В качестве вре-. менной матрицы используют капли вод-. ных. растворов вязких веществ (вяз166653, кость 2 10 сП) и хлорида кальция, кот ор ые разбрыз гивают в в од ный раст вор альгината натрия (14%), при этом образование полупроницаемой водоне-.

5 растворимой оболочки капсулы иэ аль гината кальция происходит на границе раздела поверхности временной матри= цы и раствора альгината натрия. После . формирования оболочки капсул вязкое вещество временной матрицы диффунди= рует во внекапсульное пространство ипи,. если оно остается внутри капсу= лы, не препятствует размножению кле ток и диффузии веществ. Для того,, чтобы разбрызгиваемые капли при попа дании в раствор альгината натрия со= ! храняли сферическую форму в течение времени, необходимого для формирова=

1 ния оболочки капсулы, в изотоничес= 20 кий раствор хлорида кальция с суспен=

1, дированными в нем клетками добавляют не токсичное для клеток вещество, уве= личивающее вязкость раствора. Таким образом, разбрызгиваемые капли вяз-. кого раствора являются временной мат-. рицей для формирования оболочки капсул. В качестве веществ, увеличиваюп их вязкость разбрызгиваемого раство

1 ра можно применять метил целлклоз у 30 декстран, агарозу, поливинилпирроли= дон, желатин и т.д.

Пример 1. Получение полых капсул для культивирования субстрат= независимых клеток.

Готовят 50 мл суспенэии гибридОм= ных клеток в концентрации 2 млн,кл/мп на растворе, содержащем З . метилцеллю= лозы (5 сП) и 1 хлорида кальция.

Суспенэию клеток в указанном растворе 40 из шприца каплями, являющимися временными матрицами, разбрызгивают в сосуд с 0,5 л раствора, содержащего 0,9 хлорида натрия (изотонический раствор) и 4, альгината натрия. Инкубируют кап-45 ли временной матрицы в растворе аль гината натрия при комнатной температуре и плавном перемешивании в тече ние 5 мин. После формирования оболо-. чек из альгината кальция на поверх50 ности временных матриц капсулы перено= сят в 0,9 -ный раствор хлорида натрия и инкубируют 10 мин при плавном пере мешивании для удаления непрореагиро= вавшего альгината натрия, после чего капсулы с заключенными в них клетка55 ж переносят в питательную среду для дальнейшего культивирования клеток.

Получают капсулы с полупроницаемой оболочкой толщиной 70+10 мкм, диа метр капсул 3+0,5 мм, суммарный объем полости капсул 50 мп.

Возможно использование водного раствора метилцеллюлозы с концентра цней 2-5%. (2 10 сП),, при использова— нии растворов метилцеллюлоэы в За-. предельных значениях концентраций не обеспечивается нужная вязкость.

Пример 2. Получение полых капсул для культивирования поверхностно-зависимых клеток.

Суспендируют поверхностнозависимые животные клетки из расчета

1 мпн,кл./мп и микроносители (ЦитодексЗ носитель на основе полиса харида) из расчета 20 мг/мп в раст воре, имеющем следующий состав:

2 декстрана (М.М. = 100000), З желатина (8 сП) и .1,5 хлорида кань ция, готовят 100 мп суспензии. Сус= пензию разбрызгивают иэ шприца кап лями, являющимися временной матрицей, в сосуд с 700 мп раствора, содержащего 1 . альгината натрия и 0,9 хлорида натрия. Инкубируют капли временной матрицы в растворе альги ната натрия при комнатной температу= ре и плавном перемешнванни в тече= ние 10 мин. После формирования обо*лочек из альгината кальция на поверх ности временных матриц капсулы пере= носят в 0,9 ный раствор хлорида нат= рия (1,0 л) и инкубируют 10 мин при плавном перемешивании для удаления непрореагировавшего альгината натрия, после чего капсулы с заключенными в них поверхностноэависимыми клетками и мнкроносителями переносят в пита тельную среду для дальнейшего культи. вирования клеток.

Получают капсулы с полупроницае мой оболочкой толщиной 130+30 мкм, диаметр капсул 3>5+0,5 мм, суммарный объем полости капсул 100 мп.

Возможно использование водного раствора декстрана в интервале кон центраций 1"3% (2 10 сП), при исполь зовании раствора декстрана в запре дельных значениях концентраций не обеспечивается необходимая вязкость суслензии.

Пример 3. Получение полых капсул диаметром 0,5 мм.

Капсулы с заключенными в них клет ками получают согласно примеру 1, но капли временных матриц раэбрыз гивают с помощью пульверизатора. По1 20+6

5 70+10 15

10 130+10

15 190+40

20 210+40

При использовании вязких веществ в более высоких концентрациях, т.е. 20 при вязкости более 10 сП, возникают технологические трудности, так как раствор не проходит через фнльеру ипи его прохождение сильно затрудне= но. Кроме того, увеличивается расход 25 реагентов, не приводящий к улучшению эксплуатационных свойств капсул. В случае же использования растворов с вязкостью менее 2 сП не образуется временная матрица, необходимая для формирования мембраны капсулы.

При использовании альгината натрия в концентрации менее 1Х не происходит образование мембраны капсулы, а при концентрации более 47 в силу высокой вязкости раствора альгината натрия невозможно осуществить равномерное перемешивание суспензии получаемых калсул, что приводит к образованию оболочек капсул неоднородной толщины. 40

Пример 5. Получение полых капсул для культивирования поверх ностно-зависимых клеток.

Капсулы получают согласно примеру 2, но в качестве микроносителей ис 45 пользуют "Цитолар" (на основе жела.— тины белка).

Пример 6. Получение полых капсул для культивирования субстратнезависимых клеток. 50

Капсулы получают согласно приме= ру 1, но используют 2Жный раствор метилцеллюпозы и 17ный раствор хло-. рида кальция (вязкость раствора 2 сП).

Пример 7. Получение полых капсул .для культивирования субстрат 1 независимых клеток.

Капсулы получают согласно приме ру 1, но используют 5Хный раствор

166653 лучают капсулы с диаметром 0,5+0,2 мм.

Пример 4. Получение полых капсул с различной (заданной) толщи= ной об олочки.

Капсулы получают согласно приме

5 ру 1, но время инкубации капель вре менных матриц в растворе альгината составляет 1 20 мин.

Зависимость толщины оболочки кап=10 сул от времени инкубации:

Время инкубации, Толщина оболочки, жн мкм

5 6 метилцеллюпозы и 1Ж-ный раствор хпо рида кальция (вязкость раствора 10 сП).

Пример 8. Получение полых капсул.

Капсулы с заключенными в них клет ками получают согласно примеру 1, но используют клетки линии Nama LVa или

RADJl или первично изолированные лейкоциты.

Таким образом, преимущества пред лагаемого способа заключаются в су щественном упрощении известного: уменьшается количество стадий за счет самопроизвольного растворения вре= менных матриц и формирования оболо= чек капсул одновременно с растворением временных матриц, уменьшается продолжительность процесса, происхо= днт экономия сырья, так как отпадает необходимость использования альгината натрия для формирования времен ных матриц и полилизина для формиро вания оболочек капсул, кроме того, улучшается качество капсул: их проч-. ность выше, чем при получении по из - вестному способу sa счет увеличения толщины от 5 10 до 20=250 мкм.

Капсулы прозрачны, что позволяет проводить визуальный контроль куль" тур клеток и могут быть использова= ны для культивирования кпеток разлйч" ного происхождения.

Формула изобретения

Способ получения иммобнлизованных кпеток животного происхождения, включающий получение суспензии кле= ток, образование временных гранул с кпеткамн, последующее формирование на поверхности временных гранул оболочек из альгнната кальция, получе нне гранул и растворение временных гранул, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения стабильности целевого про дукта эа счет повышения прочности оболочек полых капсул, суспенэию кпеток готовят в изотоннческом раст воре хлорида кальция и вязкого вещест ва, имеющего вязкость 2=10 сП, затем разбрызгивают суспензию в 1&X-ный раствор альгината натрия,а после формирования на поверхности времен ных гранул оболочек из альгината кальция отделяют полученные капсулы и промывают их раствором хлористого натрия для удаления непрореагировавшего альгината.