Способ электрофоретического анализа нуклеиновых кислот и устройство для его осуществления

 

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа нуклеиновых кислот, в частности к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенирования) ДНК или РНК и найдет применение в молекулярно-биологических исследованиях, биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве . Целью изобретения является повышение производительности и качества разделения. Для этого полиакриламидный гель 2 размещают в держателе 1 по внутренней vi/или наружной его цилиндрической поверхности с образованием споя геля в виде полого цилиндра. Пробы наносят на торец слоя геля по его окружности. Осуществляют термостатирование геля средством , содержащим стакан 16, теплообменник 18 и неполярную жидкость 17. На стакане 16 ы СП S

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (э )э G 01 N 27/26

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1, h

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

И

A

Фиг, j (21) 4329887/25 (22) 27,11,87 (46) 23,11,91. Бюл. М 43

{71) Институт молекулярной биологии и биохимии АН КаэССР и Институт молекулярной биологии АН СССР (72) В,Н.Гросс, Е.В.Кожанов, М.А.Айтхожин, Д.Р. 6ериташ вили и Е.Н.Твердохлебов (53) 543,257 (088,8) (56) Патент Японии

Я 49-127689, кл, 11362, 1974, Заявка Великобритании

hk 2155176, кл. G 01 И 33/50, С 07 Н 21/00.

1985. (54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО

АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ. Ж 1693514 A l (57) Изобретение относится к физико-химическим методам анализа нуклеиновых кислот, в частности к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенирования) ДНК или РНК и найдет применение в молекулярно-биологических исследованиях. биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Целью изобретения является повышение производительности и качества разделения. Для этого полиакриламидный гель 2 размещают в держателе 1 по внутренней и/или наружной его цилиндрической поверхности с образованием слоя геля в виде полого цилиндра. Пробы наносят на торец слоя геля по его окружности. Осуществляют теомостатирование геля средством, содержащим стакан 16, теплообменник

18 и неполярную жидкость 17. На стакане 16

1693514

30 у кромки и на дне установлены электроды 5 и 6, погруженные в электродные растворы, расположенные над и пад жидкостью 17. В держателе 1 готовят слой геля из раствора мономеров. Для этого держатель 1 снабжен приводам 13 его вращения, кольцевой вставкой 14 с пазами для нанесения проб, гребенкой и крышкой, Оцнородный па толщине слой геля палучакл путем вращения держателя со скоростью 800-900 оборотов в минуту и поворота оси его вращения в горизонтальное положение. В держателе 1 возможно приготовление пластины геля с разной концентрацией акриламида. Для

Изобретение относится к физика-химическим методам анализ": нуклеиновых кислот, а точнее к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенирования) ДНК или РНК, и найдет применение в молекулярно-биологических исследованиях и биотехнологии, а также в медицине и сельском хозяйстве.

Цель изобретения — повышение производительности и качества разделения.

Цель достигается существенным изме нением операций электрафоретическаго разделения анализируемых проб и конструкции электрофаретической системы.

На фиг, 1 изобра>кена устройства для осуществления способа электрофаретического анализа нуклеиновых кислот, общил вид, разрез, слой геля распола>кен на вн лренней поверхности стакана держателя, .-гэ фиг. 2 — то же, слой геля распола>кен .- а наружной поверхности стакана держателя," на фиг. 3 — устройства; " перва приготовлением гелевых пластин, общий вид, разрез; на фиг, 4 -- сечение А-А нл фиг.

3; на фиг. 5 — съемная гребенка; на фиг, 6сечение Б-Б на фиг, 3; на фиг. 7- тораидальная вставка в держателе перед приготовлением пластин геля с .различной концентрацией акриламида, разрез; на фиг. 8 — сечение В-В на фиг, 7, на флг. 9— устройство для осуществления предлагаемого способа, общий вид, разрез, oïoÀ геля размещен на внутренней и наружной поверхностях стакана держателя, Устройство содержит установленнь:й вертикально держатель 1 геля цилиндри .еской формы (фиг. 1) с размещенным в нем гелем 2, электродные растворы 3 и 4, раса:аложенные в верхней и нижней частных держателя 1 и находящиеся в электрическом контакте с гелем. Устройство содержит электроды 5 и 6, погруженные в электрадэтого он снабжен группой перегородок и тороидальнай вставкой, содержащей отверстия и группу камер для растворов манамеров, Для регистрации меченных флюорафарами молекул луч 8 источника 7 направлен в торец слоя 2 геля. Приемник 9 флюоресцентного излучения своим выходом подключен к входу вычислительного блока 11, При этом держатель 1 вращается приводом 13 са скоростью 20 — 30 об в минуту, Изобретение позволяет повысить производительность и качество анализа и упростить устройства для его осуществления. 2 с, л 1 з,п.ф-лы, 9 ил. ные растворы 3 и 4 и подключенные к источнику тока (не показан) для создания в геле электрического поля, под действием которого меченные флюрофором молекулы нуклеиновых кислот мигрируют в нижнюю часть геля, где производится регистрация флюоресценции кампанетав анализируемой пробы, Для осуществления такой регистрации устройство содержит источник 7 монохроматического излучения., луч 8 которого направлен в нижнюю часть геля 2 для возбуждения флюоресценции молекул, приемник 9 монохраматическаго излучения, оптически ориентированный на освещаемый источникам 7 участок 10 геля для ре -истрации фл ааресцентнаго излучения молекул, и вычислительный блок 11, вход которого подключен к выходу приемника 9. Таким образом, электрические импульсы, свидетельствующие а чаличии в участке 10 геля флюоресцирующих молекул, накапливак>тся в запоминающем устройстве ьычислительнога блока 11. После окончания анализа эта последовательность сигналов приемника 9 преобразуется в вычислительном блске 11 в удобную для оператора форму, отражающую первичную структуру анализлруемых нуклеиновых кислот.

Держатель " выполнен в виде стакана из диэлектрического материала, например полистирола. Возма>кно также выполнение держателя 1 из нескольких материалов. Например, внутренняя цилиндрическая поверхность его выполнена из стекла для улучшения адгезии слоя геля и поверхности держателя, а остальная ега часть — из полиметилметакрилата. При этом часть из стекла представляет собой цилиндр, закрепленный в стакане из укаэанной пластмассы, Наружная и внутренняя боковые поверхности держателя выполнены цилиндрическими. Па меньшей мере на внутрен16935 . 4 ней цилиндрической поверхности держателя 1 расположен слой геля 2 (фиг. 1} в виде полого цилиндра с лунками 12 для нанесения анализируемых проб. Лунки 12 выполнены на верхнем торце слоя геля по окружности. Держатель 1 геля снабжен приводом 13 его вращения вокруг оси, при этом держатель закреплен на валу 14 привода 13 посредством фланца 15, Привод 13 снабжен механическим генератором опорных импульсов, количество которых на оборот вала

14 равно количеству дорожек для анализируемых проб в геле 2. Кроме того один из опорных импульсов — начальный и имеет длительность больше, чем все остальные опорные импульсы, Он соответствует положению первой дорожки в позиции оптического входа приемника 9. Выход генератора опорных импульсов подключен к входу вычислительного блока 11.

Устройство снабжено средством термостатирования, содержащим стакан 16 из диэлектрического материала, например полиметилметакрилата, установленный коаксиально со стаканом держателя 1 и с зазором между боковыми стенками и дном относительно этого стакана. В указанном зазоре расположены неполярная жидкость

17, например смесь гексана и четыреххлористого углерода с плотностью 1,06 +. 0,01 г/см, и теплообменник 18 из стеклянной трубки, закрепленный на стакане 16 и подключенный через патрубки 19 и 20 к водяному термостату (не показан). Стрелками показано направление протекания воды через теплообменник. На стакане 16 устансвлены электроды 5 и 6, выполненные из платиновой проволоки в виде колец. Стакан

16 имеет на дне выступ 21, на котором установлен нижний электрод 5. При размещении слоя геля на внутренней цилиндрической поверхности держатели 1 электрод 5 установлен с наружной стороны стакана 16(фиг. 1), Электродные растворы 3 и 4 расположены в зазоре между стаканом держателя 1 и стаканом 16 под неполярной жидкос;ью 17 и над ней. Линиями 22 и 23 показаны границы между неполярной жидкостью 17 и электродными растворами 3 и

4. Плотность нижнего электродного раствора 3 составляет 1,10 + 0,01 г/см, что достигается за счет присутствия в нем сахарозы, плотность раствора 4 около 1.0 г/см . Таким образом раствор 3, неполярная жидкость и раствор 4 располагаются в стакане 1 в необходимой последовательности (фиг. I).

При размещении слоя геля на наружной цилиндрической поверхности стакана 1 держателя (фиг. 2) последний установлен внут5

55 ри стакана 16 средства термостатирования, В качестве слоя геля используются готоьые пластины геля 2 с лунками 12 для анализируемых проб, которые закрепляются на поверхности стакана держателя с помощью мягких пружинных колец (не показаны).

Электрод 5 (фиг. 2) установлен с внутренней стороны стакана 16 на выступе 21, При размещении геля на внутренней поверхности стакана держателя путем заливки в него раствора мономеров, образую.цего при полимеризации гель, стакан держателя 1 (фиг. 3 и 4) содержит в верхней исти кольцевую вставку 24, выполненную, например, из политетрафторэтилена. На наружной ее цилиндрической поверхности выполнены идентичные пазы 25 (фиг. 4 и 3) в форме кольцевых сегментов, образующих щели между внутренней поверхностью стакана держателя 1 и вставкой 24. Для образования лунок 12 (фиг. 1) при полимеризации геля в стакане держателя 1

GH снабжен схемными гребенками 26 (фиг.

5) с выступами 27, расположенными в указанных щелях, Для установки гребенок 26 в

"такан держателя 1 на наружной поверхности кольцевой вставки 24 выполнена также кольцевая проточка 28 (фиг. 1) на глубину пазов 25. Стакан держателя 1 снабжен также герметизирующим кольцом 29, выполненным, например, из вакуумной. резины, и крышкой 30 стакана держателя 1. Гребенки

26, кольцо 29 и крышка 30 установлены последовательно при формировании слоя геля из раствора монамеров. Крышка 30 снабжена отверстием 31 дл, заливки этого раствора в стакан держателя 1. Крышка закрепляется с помощью фиксаторов (не показаны) за выступ 32 стакана держателя 1.

llривод 13 вращения держателя геля установлен на поворотной платформе 33(фиг.

3) для поворота оси вращения держателя на

90 . С этой целью устройство снабжено приводом 34 платформы 33, с которым она соединена посредством вала 35. Платформа снабжена фиксаторами крайних положений (не показаны), Стакан держателя 1 содержит группу перегородок 36 (фиг. 3) из диэлектрического ма ериала, например полиметилметакрилата, установленных равноудаленно на его внутренней поверхности вдоль образующей от дна стакана до кольцевой вставки 24.

Перегородки 36 выполнены Т-образными в сечении (фиг. 6), При формировании слоя геля, состоящего из отдельных пластин, устройство дополнительно снабжено тороидальной вставкой

37, закрепленной на крышке 30 посредством четыре стоек 38, и содержит выполнен8

93514

Д

7 16

1 ные из полиметилметакрилата корпус 39, крышку 40 и перегородки 41, количество которых равно количеству перегородок 36 (фиг. 8). Перегородки 41 образуют в полости вставки 37 камеры равна-о обьема, В верхней части наружной боковой стенки тороидальной вставки 37 B месте соеденения крышки 40 и корпуса 39 в последнем выполнены прямоугольные отверстия 42 (фиг, 7 и

8) для выхода растворов мономеров из камер вставки 37 при вращении стакана держателя, Для внесения растворов мономеров в камеры тороидальной вставки

37 в крышке 30 выполнены отверстия 43.

Возможно выполнение стакана держателя, при котором его внутренняя боковая поверхность равномерно расширяется от его верхнего торца ко дну (не показано).

Конусность при таком выполнении состав, ляет около 0,07 или 0,001 рад.

В устройстве (фиг, 1 и 2) источник 7 монохроматического излучения установлен так, что луч 8 от него направлен вдоль образующей стакана держателя в нижний торец слоя геля, а приемник 9 закреплен в боковой стенке стакана 16 или средства термостатирования и оптически ориентирован перпендикулярно спою геля.

При размещении слоя геля на внутренней и наружной цилиндрической поверхностях стакана держателя 1 (фиг. 9) устройст во содержит модулятор 44 луча света исгочкчка 7 монохроматического излучения дпя направления луча 8 попеременно (лучи 45 и 6) в торец каждого из слоев геля. Для регистрации флюоресценции, возникающей в геле

2, устройство содержит также дополнительный приемник 47 монохроматического излучения, выход которого подключен к входу 48 блока 11, при этом выход приемника 9, регистрирующего излучение слоя геля 2, подключен к входу 49 этого блока.

При таком выполнении устройства стакан держателя 1 (фиг, 9) снабжен цапфой 50 на дне стакана и фланцем 51 в его верхней части для обеспечения возможности его вращения. С этой целью стакан установлен цапфой 50 в опоре 52 и снабжен подшипником 53, установленным вблизи фланца 51.

Фланец 51 выполнен в виде шкива зубчатоременной передачи, осуществляемой также посредством зубчатого ремня 54 и ведушего шкива 55, закрепленного на валу 56 привода

13 вращения держателя вокруг оси. Опора

52 установлена в выступе 21 стакана 16 средства термостатирования, Стакан держателя 1 установлен коаксиально внутри стакана 16 средства термостатирования (фиг, 9). В стакане 1 установлен коаксиально стакан l6 средства термостатирования. В зазорах между этими стаканами находятся электродные растворы 3 и 4 и неполярная жидкость 17, а также теплообменники 18, подключенные через патрубки

19 и 20 к водяному термостату, На стаканах

16 установлены кольцевые электроды 5 и 5, подключенные к источнику тока.

Устройство работает следующим образом.

B стакан держателя 1 в его вертикальном положении устанавливают кольцевую вставку 24 до соприкосновения ее нижнего торца с пере:-ородками 36 (фиг, 3) и так, чтобы кольцевая проточка 28 (фиг. 1) оказалась сверху. Затем в эту проточку и ь щели, образованные пазами 25, устанавливают гребенки 26 (фи . 5), после чего — кольцо 29 и крышку 30 (фиг. 3). Последнюю закрепляот в держателе фиксаторами за выступ 32, что обеспечивает герметичное прижатие кольца 29 к стакану держателя 1.

Через отверстие 31 в крышке 30 вводят до дна держателя трубку для подачи инертного газа или азота и осуществляют заполнение стакана держателя этим газом в течение 2-3 мин при расходе газа 5-10 л в минуту.

Затем газовую трубку удаляю- и через отверстие 31 в стакан заливают смесь мономеров. Обьем смеси предварительно расc-÷èтывают, исходя из необходимости толщины слоя геля, Сразу после заливки смеси включают привод !3 вращения держателя и увеличивают скорость его вращения до 800 — 900 об. в минуту, B результате раствор мономеров покрывает всю внутреннюю циль дрическую поверхность стакана, но толщина Слоя геля при этом неодинакова

ro высоте стакан". Затем вкл:очают привод

34 (фиг. 3) и одновременно отключают фиксатор вертикального положения стакана держателя 1 для перевода оси его вращения в горизонтальное положение. По достижении стаканом держателя 1 этого положения включают фиксатор горизонтального положения стакана держателя 1. В этом положении смесь мономеров покрывает поверхность стакана держателя 1 равномерным слоем одинатоковой толщины и затекает также в щели, образованные пазами

25 кольцевой вставки 24 и стаканом держателя 1. При этом пузыри воздуха из этих щелей выдавливаются через участки соприкасающихся поверхностей гребенки, пазов

25 и стакана держателя 1 раствором мономера за счет действия на него центробежных сил, Вращение стакана держателя 1 в горзонтальном его положении проводят в течение 20-30 мин, за это время происходит

16935 t 4 полимеризация мономеров с образованием слоя геля. Затем стакан держателя возвращают в вертикальное положение приводом

34 и снимают крышку 30 и кольцо 29. На этом заканчиваются операции размещения слоя геля на внутренней цилиндрической поверхности стакана держателя 1 путем заливки в него раствора мономеров.

Для продолжения анализа в стакане держателя 1 (фиг. 1) подвешивают и жестко закрепляют коаксиально с ним и с зазором стакан 16 средства термостатирования с закрепленными на нем электродами 5 и 6, теплообменником 18 и приемником 9. B зазор заливают сначала нижний электродный раствор 3 до уровня, расположенного немного ниже оптического входа приемника 9, после чего заливают неполярную жидкость примерно до половины высоты кольцевой вставки 24, затем верхний электродный раствор до выступа 32 (фиг. 1 и 3), Пинцетом извлекают из проточки 28 гребенки 26 и шприцом промывают гелевые торцы в лунках 12, используя для этого раствор 4.

Включают термостат и прогревают неполярную жидкость до необходимой температуры, равной обычно 323 К, на торцы геля в лунках 12 наносят капилляром анализируемые пробы в обьеме 1 — 2 мкл и подают необходимое напряжение на электроды 5 и

6. Затем включают привод 13 стакана держателя 1 и устанавливают скорость его вращения равной 20-30 об. в минуту. После этого включают источник 7, приемник 9 и вычислительный блок 11, В результате начинается электрофоретическое разделение анализируемых проб при контролируемых температурных условиях и прогрев блоков регистрации (источника 7, приемника 9 и вычислительного блока 11).

Под действием электрического поля молекулы нуклеиновых кислот мигрируют в направлении анодного торца геля (фиг. 1). В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, что приводит к разделению смеси молеку, на отдельные ее компоненты, каждая из которых представлена в геле зоной, содержащей одинаковые молекулы, мигрирующие с одной скоростью. В нижней части геля 2 (фиг. 1) достигается оптимальное разделение этих зон и они могут быть зарегистрированы раздельно. Для регистрации молекул нуклеиновых кислот в процессе их электрофоретического разделения к ним перед анализом ковалентно присоединяют молекулы флюоренсцирующего вещества, служащего меткой анализируемых молекул.

По достижении лидирующей зоной участка 10 геля начинается автоматическая ре5

50 гистрация компонентов анализируемых проб. При этом по опорным и начальному импульсам, поступающим в блок 11 от привода 13, в группы ячеек памяти блока 11, количество которых равно количеству дорожек для анализируемых проб, заносятся импульсы, поступающие от приемника 9. За время электрофоретического прохождения любой из зон участка 10 геля проводится несколько десятков измерений интенсивности флюоресценции каждой из зон, Это позволяет уменьшить статистическую погрешность результатов анализа.

С целью повышения производительности анализа путем сокращения времени его выполнения в устройстве возможно проведение анализа одновременно в нескольких пластинах геля, имеющих различную концентрацию акриламида. Анализ в устройстве в этом случае выполняют следующим образом.

После установки в стакан держателя 1 кольцевой вставки 25 (фиг. 3-5), гребенки 26 и кольца 29 в него устанавливают крышку 30 (фиг, 7) с закрепленной на ней тороидальной вставкой 37. Крышку 30 поворачивают вокруг оси стакана держателя 1 так, чтобы перегородки 41 оказались напротив перегородок 36 стакана держателя 1 (фиг. 8), после чего крышку 30 закрепляют фиксаторами аналогично укаэанному. Осуществляют заполнение стакана держателя 1 инертным газом или азотом и затем через отверстие 43 в крыщке 30 (фиг, 7) заливают в камеру вставки 37 растворы мономеров.

Количество отдельно приготовленных растворов равно количеству камер, а растворы с одинаковой концентрацией акриламида заливают в камеры, расположенные во вставке 37 одна напротив другой. Таким образом с помощью вставки 37 (фиг, 7 и 8) заливают четыре пластины геля, из которых две имеют низкую, например 8 $„а две— высокую, например 167, концентрации акрила мида, Включают привод 13 и по мере увеличения оборотов стакана держателя 1 растворы мономеров выливаются за счет центробежных сил из камер через отверстия 42 на поверхность стакана держателя 1, причем каждый раствор — на участок, ограниченный перегородками 36, дном стакана держателя

1, вставкой 24 и гребенкой 26. Быстро возрастающие центробежные силы препятствуют стеканию растворов на дно стакана держателя 1. Дальнейшая работа устройства аналогична указанной за исключением операции внесения в лунки 12 (фиг, 1) анализируемых проб. Каждую пробу разделяют на две части, одну из которых наносят на

1693514

35 гель с низкой концентрацией акриламида, а другую — H3) гель с высокой его концентрацией.

Возможно использование готовых пластин геля, При размещении пластин еля на наружной цилиндрической поверхности стакана держателя 1 устройство работает следующим образом.

Пример 1, Подготовку устройства к заливке в стакан держателя 1 раствора мономеров проводят по (фиг. 1), Раствор мономеров готовят из расчета получения слоя геля толщиной 0,3 мм, объемом 36 мл в стакане держателя, имеющем внутреннлй диаметр 200 мм и высоту поверхности для слоя геля 200 мм. Раствор мономеров для проведения секвенирующего электрофореза в

8,(-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях содержит в 36 мл раствора 2,9 r акриламида, 0 15 г бисакриламида, 0.036 мл ГЕМЕД, 0.018 г персульфата аммония. 0,39 r трис-0Н, 0,2 r борной кислоты, 0,035 г ЭДТА (натриевая соль) и 15,1 г мочевины.

Затем раствор мономеров сразу после приготовления (персульфат аммония и ТЕМЕД добавляют в последнюю очередь) заливают в стакан держателя 1 и выполняют операции полимеризации слоя геля. Слой геля после полимеризацли раствора мономеров имеет гладкую поверхность без остатков жидкой фазы.

Используют электродные растворы следующего состава. Раствор 4 (верхний); ". л раствора содержит 10,8 Трио ОН, 5,5 r борнои кислоты, 0,9.l r ЭДТА i!Iaz - 2 HgQ u pH

8,3, раствор 3 (нижний) — те же компонен гы и дополнительно в 1 л 260 г сахарозы. В качестве неполярной жидкости используют смесь гексана и четыреххлООистого углерода с плотностью 1,06+0,01 г/см, Растворы заливают в указанной последовательности, после чегс выполняют остальные операции до нанесения анализируемых проб на гель.

В каждую лунку 12 (фиг, 1) вносят по 1,5 мкл раствооа 4, содержащего мочевину (7 Mi) и по 0,025% маркерных красок: бромфенолового голубого и ксиленцианолового, r;осле чего на электроды подают напряжение.

Электрофорез ведут при напряжении 650 В, . при этом величина тока через слой геля составляет 70-?5 мА, Скорость движения красителей состав lReT для бромфенолового голубого, имеющего злект рофоретическую подвижность, эквивалентную молекулам

ДНК или РНК длиной в 25-30 нуклеотидов, 1?5 мм в час, для ксиленцианолового, имеющего подвижность, эквивалентную молекулам длиной 70-85 нуклеотидов, 93 мм в час, Результаты замеров расстоя ий, пройденных красками через 1 и 2 ч во всех дорожках слоя геля дали разбор значений

0,3-0,5 мм, что при разрешении зон, равном

1,2-1,4, достигаемом в пластине используемой длин ы, соответствует погрешности электрофоретического анализа менее 0,5%.

Пример 2, Подготовку проб, меченных флюорофором, для определения первичной структуры ДНК по предлагаемому способу проводят следующим образом, Набор фрагментов секвенируемой молекулы ДНК получают методом терминирования реакции полимеразного копирования

ДНК по Сенгеру. Для мечения фрагментов

ДНК флюорофором используют химически синтезированную олинонуклеотидную затравку, Синтез фрагментов ДНК веду в системе фага М13. Затравку коньигируют с флюоресцелном.

К 2 мкл раствора. содержащего около

0,2 пмоль анализируемой ДНК, добавляют

0,6 пмоль меченной затравки в объеме 0,5 мкл, Затравка должна быть растворена в десятикратном буферном растворе следующего состава. 0,5 M NaCI, 66 мМ трис-HQ, рН 7,4, 66 мМ MgClz, 10 мМ ДТТ, Тщательно перемешивают полученную смесь и помещают ее в кипящую водяную баню обьемом

500 мл на 3 мин, Затем баню выключают и оставляют остывать до комнатной температуры, что происходит примерно в течение двух часов. По окончании в реакционной смеси образуются гибридные молукулы

ДНК+ -àòðàâêà,,Затем к смеси добавляют до конечного объема 10 мкл буферный раствор cocTdsB; 50 MM трис-HCI, рН 8,5 мМ

MgClz, 2 мМ ДТТ. Разбавленную таким образом смесь делят по 2 мкл в четыре пробирки для проведения реакции терминирования полимеразного копирования по четырем основаниям.

В каждую пробирку добавляют по 1 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dN ТР), конценрация каждого 0,125 мМ, и по 1 мкл соответствующих дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ddN ТР) в следующих молярных соотношениях: d А/dd А=1, dT/dd Т-6, dG/ddG=6, dC/ddC=2,5. В каждую пробирку добавляют по 1 мкл раствора обратной транскриптазы с удельной активностью 1 ед./мкл, тщательно перемешивают и инкубируют при 37 С в течение 15 мин.

Затем в каждую пробу добавляют по 1 мкл смеси dN TP в концентрации 0,5 мМ каждого и инкубируют еще 15 мин, Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 99 ф,-ного раствора формамида с красками: бромфеноловым голубым и ксиленцианоловым (0,5% каждого) и 20 мМ ЭДТА, 13

i 693514

50

Проводят полимериэацию слоя геля в держателе 1 (фиг. 1) и заливку электродных растворов неполярной жидкости по примеру 1. Пробы, полученные ранее, кипятят в течение 3 мин и наносят на гель. В каждую лунку 12 вносят по 2 мкл анализируемой пробы и проводят электрофоретическое разделение и регистрацию компонентов анализируемых проб указанным образом.

При регистрации в устройстве используют аргоновый лазер в качестве источника 9 монохроматического излучения. Для выделения флюоресцентного излучения используют интерференционный фильтр на

520 нм.

В изобретении использование радиально-симметричного и рин ци па и ри размещении слоя геля в -держателе, при его термостатировании и регистрации компонентов анализируемых проб позволяет повысить производительность и качество анализа и упростить устройство для его и роведения. Например, при диаметре стакана держателя, равном 240 мм, анализ можно вести по 160 дорожкам, т.е. параллельно анализировать первичную структуру 40 фрагментов ДНК длиной по 300 нуклеотидов каждый. Это соответствует производительности секвенирования, равной 25-30 тыс. нуклеотидов а сутки, т.е. в 25-30 раз выше, чем при использовании известного устройства. При этом увеличение ширины геля с целью дальнейшего повышения производительности анализа приводит к увеличениюдиаметра стаканадержателя лишь на

1/3. Таким образом, в устройстве луч источника монохроматического излучения направлен в нижнюю часть геля, приемник монохроматического излучения оптически ориентирован на освещаемый источником монохроматического излучения участок геля, вычислительный блок входом подкл ючен к выходу приемника монохроматического излучения, держатель геля выполнен в виде стакана из диэлектрического материала. по меньшей мере на внутренней цилиндрической поверхности которого расположен слой геля в виде полого цилиндра с лунками для анализируемых проб на его торце по окружности, держатель геля снабжен приводом

его вращения вокруг оси, имеется средство термостатирования, содержащее стакан из диэлектрического материала, установленный коаксиально со стаканом держателя и с зазором между боковыми стенками и дном относительно этого стакана, неполярную жидкость и теплообменник, расположенные в зазоре между стаканами, электроды выполнены кольцевыми и установлены коаксиально со стаканом средства

40 термостатирования один в верхней части этого стакана, а другой — на дне этого же стакана снаружи или внутри, при этом электродные растворы расположены в зазоре между стаканами под неполярной жидкостьа и над ней.

Такое выполнение способа электрофоретического анализа нуклеиновых кислот и устройства для его осуществления позволяет резко поьысить производительность анализа за счет увеличения ширины пластины геля и, следовательно, количества дорожек для анализируемых проб.

Благодаря радиально-симметричному расположению геля, электродов и элемента термостатирования и выбору направления электрофореза вдоль образующей обеспечиваются идентичные для всех дорожек условия разделения анализируемых молекул.

Вследствие этого повышается качество анализа: улучшаются достоверность и воспроизводимость результатов и повышается их точность.

Вращение держателя вокруг его оси в процессе злектрофореэа, осуществляемое с целью регистрации компонентов анализируемых проб, обеспечивает вместе с тем постоянное и равномерное перемешивание как буферных растворов, так и неполярной жидкости, что также способствует повышению качества анализа за счет поддержания однородного состава буферных растворов, удаления пузырьков газа с электродов и улучшения теплопередачи неполярной жидкости.

Перемещение геля относительно луча источника монохроматического излучения, осуществляемое путем вращения держателя, обеспечивает одинаковые и геометрически правильные стартовые участки гелевой пластины. Кроме того, упрощение устройства достигается за счет простых и надежных средств герметизации и исключения необходимости в спейсе-рах (прокладках, определяющих толщину гелевой пластины) Заливку раствора мономеров в держатель и его вращение до достижения скорости, при которой раствор мономеров покрывает всю внутреннюю цилиндрическ чю поверхность держателя, осуществляют при вертикальном расположении оси вращения держателя, а окончательную полимеризацию геля — при горизонтальном ее расположении. Для этого в устройстве привод вращения держателя геля установлен на поворотной платформе для поворота оси вращения держателя и, следовательно, повышает качество анализа.

При формировании слоя геля, состоящего из отдельных пластин, оно дополнитель1693514

30 3 5

50 но снабжено тороидальной вставкой для измещения раствора мономеров, закрепленной на крышке стакана держателя, с радиальными перегородками по количеству перегородок стакана держателя и с отверстиями, ажелиенными в верхней части ее наружной боковой стенки, Это позволяет сформировать в одном держателе-несколько пластин геля, имеющих рваличную пористость и, следовательно, оказывающих различное задерживающее воздействие на низкомолекулярные и высокомолекулярные компоненты анааизируемых проб, Тем самым достигается выравниаание разрешения укаэанным компонентов проб, т.е, повышение качества анализа. Воэможность осуществления этого в одном дер.кателе и в ходе одного и того же анализа обеспечивает повышение производител ьности работы и упрощение устройства для осуществления анализа, Вместе с тем использование пластин геля с разной концентрацией акриламида для анализа одной и той же пробы позволяет сократить время его проведения, так как высокомолекулярные компоненты пробы можно регистрировать в пластине с низким содержанием акриламида, где их подвижность выше, чем в пластине с низкой пористостью. Необходимое разделение низкомолекулярной части анализируемой пробы достигается за то же время в пластине с высоким содержанием акриламида, Таким образом, эа счет сокращения времени анализа достигается повышение его производительности.

Внутренняя боковая поверхность стакана держателя выполнена равномерно расширяющейся от его верхнего торца к дну.

Благодаря этому возможно получение пластины геля, у котброй сечение равномерно возрастает от стартовой зоны в направлении миграции анализируемых молекул. Это приводит к постепенному снижению плотности тока в указанном направлении, что способствует выравниваю разрешения для коротких и длинных полимерных цепей нуклеиновых кислот. Таким образом достигается повышение качества анализа, Источник монохроматического излучения установлен так, что луч света от него направлен вдоль образующей стакана держателя в нижний торец слоя геля, а приемник монохроматического излучения закреплен в боковой стенке средства термостатирования вблизи его дна и оптически ориентирован, перпендикулярно слою геля.

Такое выполнение системы регистрации компонентов анализируемых проб позволяет устранить влияние флюоресценции материала стакана держателя на результаты измерения флюоресценции анализируемых молекул благодаря тому. что участок держателя, освещаемый источником излучения, пространственно отделен от участка, на который сориентирован приемник монохроматического излучения. Это обеспечивает повышение качества анализа, Ошибка анализа при использовании изобретения в 2-3 раза ниже, чем при использовании известного, Однако это не единственный показатель повышения качества, необходимо также учитывать факторы, не поддающиеся прямой количественной оценке. Это уменьшение вероятности критических ситуаций и сбоев и снижение влияния дестабилизирующих факторов на процесс анализа, Формула изобретения

1. Способ электрофоретического анализа нуклеиновых кислот, включающий приготрвление геля полимеризацией в держателе йэ раствора мономеров, нанесение на гель анализируемых проб, вохдействие на них электрического поля и регистрацию проб в процессе электрофоретического разделения, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения производительности и качества разделения, разделение проводят в геле„выполненном в виде полого цилиндра, причем анализируемые пробы наносят на торец слоя геля по окружности, воздействие на пробы злектрическо о поля осуществляют вдоль образующей цилиндрического геля, а регистрацию компонентов геля осуществляют при вращении его вокруг оси, причем перед заливкой раствора мономеров держатель заполняют инертным газом или азотом.

2, Устройство для злектрофоретическо- . го анализа нуклеиновых кислот, содержащее установленный вертикально держатель геля цилиндрической формы с размещением в нем геля, электродные растворы, расположенные в верхней и нижней частях держателя и находящиеся в электрическом контакте с гелем, электроды, погруженные в электродные растворы и подключенные к источнику тока, средство для формирования слоя геля, источник монохроматического излучения, луч которого направлен в нижнюю часть геля, приемник монохроматического излучения, оптически ориентированный на освещаемый источником монохроматического излучения участок геля, и вычислительный блок, вход которого подключен к выходу приемника монохроматического излучения, о т л и ч à ю щ ее с я тем, что, с целью повышения производительности и качества анализа, держатель для гелия и средство для термостатирования выполнен

1693514 в виде коаксиально расположенных стаканов из диэлектрического материала, установленных с зазором, в котором циркулирует хладагент, в качестве которого использована неполярная жидкость, при- 5 чем электродные растворы расположены в зазоре между стаканами над неполярной жидкостью и подней, электроды выполнены кольцевыми и установлены коаксиально по отношению к центральной оси, при этом 10 стакан держателя содержит в верхней части кольцевую вставку с выполненйой íà ее наружной цилиндрической поверхности группой индентичных пазов в форме кольцевых сегментов, образующих щели между внут- 15 ренней поверхностью стакана держателя и вставкой, и группу Т-образных перегородок иэ диэлектрического материала, установленных равноудаленно на его внутренней поверхности вдоль образующей от дна стакана до кольцевой вставки, причем внутренняя боковая поверхность стакана держателя выполнена равномерно расширяющейся от его верхнего торца ко дну.

3. Устройство по п.2, отл и ча ю щеес я тем, что средство для формирования слоя геля выполнено в виде тороидальной вставки для раствора мономеров, снабжено радиальными перегородками по количеству перегородок держателя геля и отверстия, выполненными в верхней части ее наружной боковой стенки, и расположено на крышке стакана — держателя.

1693514

1693514

2Е

Фиг.5

26

84

Фиг: 7

1693514