Способ определения активности фитоадаптогенов

 

Изобретение предназначено для использования в химико-фармацевтической промышленности и'мeдvlцинe для определения активности фитоадаптогенов. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается за счет определения антиокислительной активности (АОА) препаратов. 5 мл исследуемого фитоадаптогена упаривают (до полного удаления спирта) до сухого остатка и далее готовят водный раствор с содержанием его в 1 мл не менее 10 мг и не более 12 мг, определяют влияние водного раствора на показатель скорости "медленной вспышки" Fe^^-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ), рассчитывают коэффициент ХЛ, пропорциональный АОА, и при значении этого коэффициента. ХЛ, находящегося в пределах более 1, ?fi определяют высокую адаптогенную активность препаратов. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

{5цю -G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

2, К АаТОГСКОМ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4659595/14 (22) 06.03,89 (46) 15.02,92. Бюл. N- 6 (71) Научно-исследовательский институт технологии и безопасности лекарственных средств . (72) В. M. Гукасов, Е. В, Крюковская, Л. P.

Галушкина, А. Н. Кудрин, Е. Я. Каплан, Ф. П;

Крендаль и Л. В. Левина (53) 612.015(088.8) (56) В Ф С 42-1281-82. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФИТОАДАПТОГЕНОВ

{57) Изобретение предназначено для использования в химико-фармацевтической промышленности и медицине для определеИзобретение относится к медицине, а именно к способам оценки эффективности лекарственных средств, и может быть использованоо в химико-фармацевтической промышленности.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается путем определения влияния водного раствора сухого остатка на показатель скорости медленной вспышки

Fe -индуцированной хемилюминесценции 2+ (ХЛ).

Способ осуществляют следующим образом.

5 мл спиртового раствора выпаривают досуха при 70 С, разводят в 1 мл дистиллированной воды, Изучают следующие разведения препаратов: 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:20;

1:40. 1:80; 1:100; 1:200 с целью выявления

„„5U 1712870 Al ния активности фитоадаптогенов. Цель изобретения — повышение точности способа.

Цель достигается за счет onределения антиокислительной активности (АОА) препаратов. 5 мл исследуемого фитоадаптогена упаривают (до полного удаления спирта) до сухого остатка и далее готовят водный раствор с содержанием его в 1 мл не менее 10 мг и не более 12 мг, определяют влияние водного раствора на показатель скорости

"медленной вспышки" Fe -индуцирован+ ной хемилюминесценции (ХЛ), рассчитывают коэффициент ХЛ, пропорциональный

АОА, и при значении этого коэффициента.

ХЛ, находящегося в пределах более 1, 9, определяют высокую адаптогенную активность препаратов. 4 табл, степени ингибирования ими перекисного окисления липидов (ПОЛ). Эффективными являются разведения, ингибирующие ПОЛ на 50 . Для настойки аралии такое разведение составляет 1:4, для экстракта элеуте- Я рококка — 1:20, для настойки женьшеня — 1;2 CQ (содержание сухих веществ в ячейке составляет 0,2 мг в 1 мл суспензии для всех вышеуказанных препаратов в данных разведениях). Остальные разведения изучаемых препаратов либо вызывали полное, ингибирование ПОЛ, либо давали результаты, достоверно не отличающиеся от контроля. Суспензию готовят из желтка куриных яиц путем перемешивания его с фосфатным буфером {20 мл КН2РО4, 105 ммоль KCl, рН

7,4) в соотношении 1:1 на магнитной мешалке со скоростью 500 об/мин в течение 10 мин. 1 мл липосом помещают в термостати1712870 руемую кювету (при 37 С), которую устанавливают в светонепроницаемой камере над торцом фотоэлектронного умножителя

ФЭУ-39А-хемилюминометра. К липосомам добавляют 2,9 мл фосфатного буфера и 0,1 мл раствора препарата. После 3 мин инкубации при постоянном перемешивании содержимого при 380 об/мин открывают шторку, отделяющую дно кюветы от торца

ФЭУ, регистрируют исходный уровень ХЛ, после чего в ячейку вводят 1 мл 10 М рас-2 твора FeS0< с последующей регистрацией всех стадий ХЛ (быстрая вспышка, латентный период, медленная вспышка). Таким образом оценивается действие всех укаэанных выше разведений препаратов, концентрация сухого остатка в которых была известна. Рассчитывают скорость медленной вспышки ХЛ, измеренную как tg угла наклона начальной экспоненциальной, части медленной вспышки.. Затем рассчитывают коэффициент ХЛ, пропорциональный антиокислительной активности лекарственных препаратов:

Кхл= oo О где оо -zg угла начальной экспоненциальной части медленной вспышки ХЛ липосом без препарата; о — tg угла наклона начальной экспоненциальной части медленной вспышки ХЛ липосом в присутствии препарата, Пример 1. Настойка аралии ХФЗ 06.87, и настойка аралии МФ 06,87. Проведена сравнительная оценка адаптогенной активности на моделях гипоксической гипоксии, гипероксии и ишемии ЦНС и сердечно-сосудистой системы у лягушек.

Гипоксическая гипоксия. Опыт проводили на белых беспородных мышах массой

20 г средней устойчивости к гипоксии. Предварительно в течение 2 дней мышам вводили по 0,1 мл водного раствора препарата внутрибрюшинно, контрольной группе вводили по 0,1 мл дистиллированной воды. На третий день(день эксперимента) препараты вводили за три часа до начала эксперимента. Гипоксическая гипоксия достигалась разряжением на высоте 11 км, подъем осуществляли втечение 110 с. Определяли срок гибели мышей.

Гипербарическая оксигенация. Эксперименты проводили на белых беспородных мышах массой 20 r. Предварительно в течение 2 дней мышам вводили по 0,1 мл водного раствора препарата внутрибрюшинно, контрольной группе вводили. такое же количество дистиллированной воды, На третий день (день эксперимента) препараты вводили за три часа до начала эксперимента, Гипербарическую оксигенацию создавали в барокамере при 5 ати в течение 40 мин, Срок компрессии и декомпрессии равен 20 мин.

Определяли время наступления судорог, срок жизни в барокамере и процент гибели.

Ишемия ЦНС и сердечно-сосудистой системы. Исследования проводили на лягушках-самцах (Яапа temporaria) на модели ишемии ЦНС и сердечно-сосудистой систе10 мы, предложенной А. Н. Кудриным. Водные растворы препаратов вводили лягушкам в задний лимфатический мешок в течение 2 дней. В первый день препараты вводили дважды с интервалом в 3 ч. На второй день (день эксперимента) препараты вводили за

3 ч до начала эксперимента, Контрольным

55 лягушкам вводили в течение 2 дней по 0,1 мл дистиллированной воды. До начала введения препаратов лягушки сутки находились при комнатиой температуре (+18 С) и далее во время эксперимента также находились при той же температуре. У лягушек прекращали кровообращение путем каложения лигатуры на дугу аорты. Затем фиксировали сроки угасания простого рефлекса спинного мозга (вынимание лапки из 0,35 /ного раствора серной кислоты). После пре- кращения рефлексов оставляли лигатуру на аорте в течение 20 мин (срок относительной биологической смерти для ЦНС, после которого происходит самопроизвольное восстановление рефлексов), Затем проводили реперфузию ЦНС и всего организма возобновлением кровообращения путем снятия лигатуры с дуги аорты и наблюдали за последующим восстановлением рефлексов

ЦНС. Отмечали срок восстановления простого рефлекса спинного мозга и процент гибели лягушек после реперфузии.

Для определения антиокислительной активности и расчета коэффициента ХЛ, пропорционального антиокислительной активности лекарственных препаратов, измеряли скорость медленной вспышки ХЛ липосом при инкубации с водным раствором препарата, содержащим сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии. Определение проводили для двух серий настоек аралии (табл. 1). При определении коэффициента ХЛ настойки аралии ХФЗ 06.87. сЪ=

= 1,51, значение о =- 0,76. Кхл= сг / (г =

=1,51f0,76=1,99, что выше нижнего уровня доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для настойки аралии. Это свидетельствует о высокой антиокислительной активности. При определении коэффициента ХЛ настойки аралии МФ 06.87. значение оо= 1,51, значение а = 1,42. Кхл= ао/а ==1,51/1,42=1,06, что ниже нижнего уровня

1712870 доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для настройки аралии (это свидетельствует о низкой антиокислительной активности).

° Настойка аралии ХФЗ 06.87. обладает 5 более высокой адаптогенной активностью при ишемии ЦНС лягушки, гипероксии, при отсутствии. достоверных различий между ними при гипоксической гипоксии. Коэффициент ХЛ настойки аралии с высокой адап- t0 тогенной активностью составляет 1,9 и выше. Сухой остаток в настойке аралии

ХФЗ 06.87, составляет 3,2%, в настойке аралии. МФ 06.87. — 2,8 . Адаптогенная активность настойки аралии ХФЗ 06.87. 15 отличается от настойки аралии МФ 06,87. по методике ишемии ЦНС лягушки соответственно на 33, по значению коэффициента

ХЛ вЂ” на 59,2%, то по сухому остатку — на

13%, что свидетельствует о том, что способ 20 стандартизации по значению коэффициента ХЛ является более точным, чем прототип.

Пример 2. Экстракт элеутерококка завод "Санитас" 12.84. и экстракт злеутерококка ХФЗ 12,86. Проведена оценка адап- 25 тоген ной активности на моделях гипоксической гипоксии, гипероксии и ишемии ЦНС и сердечно-сосудистой системы у лягушек. Методики проведения идентичны для настойки аралии, Измеряли скорость 30 медленной вспышки ХЛ при инкубации с водным раствором препарата, содержащим сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии. Определение проводили для двух серий экстракта элеутерококка (см. табл. 2). 35

При определении коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка ХФЗ 12 86. ао =

=0,77, значение а =. 0 3, Кхл= стlи

=0,77/0,3=2,56, что выше нижнего уровня доверительного интервала значений козф- 40 фициента ХЛ для экстракта элеутерококка.

Это свидетельствует о высокой антиокислительной активности. При определении коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка завода "Санитас" 12.84. значение оо= 45

= 0,77, значение (т = 0,7, Кхл= ст,/ст =

=0,77/0,7=1,1, что ниже нижнего уровня доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка, Это свидетельствует о низкой антиокислитель- 50 ной активности, Экстракт элеутерококка ХФЗ 12.86. обладает более высокой адаптогенной актив- ностью при ишемии ЦНС лягушки, гипероксии, гипоксической гипоксии. Ко- 55 эффициент ХЛ экстракта элеутерококка с высокой адаптогенной активностью составляет l,9 и более. Сухой остаток в экстракте элеутерококка завода "Санитас" 12,84, равен 8,2, в экстракте элеутерококка ХФЗ

12.86. — 6,3 . Адаптогенная активность экстракта элеутерококка ХФЗ 12.86, отличается от экстракта элеутерококка завода

"Санитас" 12.84. по методике ишемии ЦНС лягушки соответственно на 15,4 („значение коэффициента ХЛ вЂ” на 42,9, по методике прототипа, содержание сухого остатка в экстракте элеутерококка завода "Санитас" больше на 23,2 . Это свидетельствует о том, что способ стандартизации с использованием коэффициента ХЛ является более точным, чем прототип.

Пример 3. Настойка женьшеня ХФЗ

10.84. и настойка женьшеня ХФЗ 08.87.

Проведена сравнителная оценка адаптогенной активности на моделях гипоксической гипоксии и на устойчивость животных к повторным физическим нагрузкам. Методика проведения гипоксической гипоксии (см. пример 1).

Полученные результаты приведены в табл. 3.

Изучение влияния препаратов женьшеня на устойчивость животных к повторным физическим нагрузкам. В экспериментах были использованы белые беспородные мыши — самцы массой 18 — 25 г. Предварительно животные были подвергнуты отбору по показателям физической работоспособности— плавание до полного утомления в бассейне с постоянной температурой 25 С. Критерием о бора служила продолжительность плавания не менее чем 4 мин. При проведении исследований животным при первом плавании предлагалась физическая нагрузка, составляющая 80 от максимальной. При повторном плавании, которое осуществлялось спустя 2 ч после завершения первого плавания, животные выполняли физическую нагрузку до максимального утомления.

Критерием оценки эффективности препаратов служило увеличение длительности повторного плавания по сравнению с контролем, Для получения стабильных результатов и уменьшения "разброса" вариационного ряда экспериментальных данных животным подвешивали специально при- . способленный груз, не затрудняющий движений и составляющий 5 от массы тела.

Препараты вводили опытным животным в течение 7 дней, а в последний день за 1 ч до повторного плавания внутрибрюшинно в дозах 1 — 20 мл/кг. Контрольным животным в том же режиме внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в тех же объемах, что и опытным животным. Продолжительность плавания животных регистрировали в секундах.

1712870

Таблица 1

Сравнительная оценка параметров хемилюминесценции препаратов аралии при разведении 1:4

Измеряли скорость медленной вспышки ХЛ липосом при инкубации с водным раствором препарата, содержащим сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии, При определении коэффициента ХЛ, про- 5 порционального антиокислительной активности, для настойки. женьшеня ХФЗ 08.87., значение оо=1,09, значение о=0,46. Кхл=

= oo/o =1,09/0,46=2.46, что выше нижнего уровня доверительного интерала значений 10 коэффициента ХЛ. Это свидетельствует о высокой антиокислительной активности.

При определении коэффициента ХЛ для настойки женьшеня ХФЗ 10.84 значение 0<=

1,09, значение o = 1,28. Кхл= оо/О

=1,09/1,28=0,85, что ниже нижнего уровня . доверительного интервала значений коэффициента ХЛ. Зто свидетельствует о низкой антиокислительной активности, Настойка женьшеня ХФЗ 08.87. облада- 20 ет более высокой адаптогенной активностью при гипоксической гипоксии, устойчивости животных к повторным физическим нагрузкам. Сухой остаток настойки женьшеня ХФЗ 08.87, составляет 2,7%. а в настойке женьшеня ХФЗ 10.84.-2,4%.

Адаптогенная активность настойки женьшеня ХФЗ 08.87. отличается от настойки женьшеня ХФЗ 10.84. по показателю их влияния на физическую выносливость (продол- 30 жительность повторного плавания) при дозе

5 мл/кг соответственно на 63,7, по методу гипоксической гипоксии — на 33,5%, по значению коэффициента ХЛ вЂ” на 40,3 ; а по методике прототипа содержание сухого ос- 35 татка отличается на 0,3о . Это свидетельствует о том, что способ оценки эффективности с использованием коэффициента ХЛ является более точным, чем прототип.

Таким образом, результаты изучения влияния водного раствора на показатель скорости медленное вспышки Fe -индуци + рованной ХЛ свидетельствует о том, что при значении коэффициента ХЛ для настоек аралии и женьшеня, а также экстракта эле-. утерококка выше 1,9 (при содержания сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии) препараты обладают высокой адаптогенной активностью (табл, 4).

Формула изобретения

Способ определения активности фитоадаптогенов путем исследования сухого остатка раствора фитоадаптогена, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуют влияние водного раствора фитоадаптогена на скорость

+2 медленной вспышки Ге .-индуцированной хемилюминесценции, затем рассчитывают коэффициент хемилюминесценции, пропорциональный антиокислительной активности фитоадаптогена по формуле Кхл=

= <то/о, где op-tg угла наклона начальной экспоненциальной кривой медленной вспышки хемилюминесценции липосом без препарата; ст- ц угла наклона той же кривой в присутствии исследуемого фитоадаптогена и при значении коэффициента хемилюминесценции выше 1,9, определяемой высокую адаптогенную активность препарата.

1712870

Табли ца 2

Сравнительная оценка параметров хемилюминесценции препаратов элеутерококка при разведении 1:20

Опыт

Экстракт элеутерококка

ХФЗ 12.86

Экстракт элеутерококка завода "Санитас" 12.84

v . (7о/8 - 5 Go/G

0 38

0,38

0,32

0,3

0,38

1,1

1,1

1,07

1,87

1,92

0,7

0,7

0,72

0,49

0,4

2,02

2,02

2,4

2,56

2,02

О, 77

0,6+0,07

0,77

0>3510,02

1,35+0, 18

1,85:0,85

2, 2+01

2,5-:1 9

Т а б л и ц а 3

Сравнительная оценка активности препаратов женьшеня по показателю .продолжительности жизни животных на модели острой гипоксической гипобарической гипоксии

Продолжительность жизнй, мин

Количество живот ных в группе

Изменение продолжительности жизни животных, ь по отношению к контролю

Препарат

Доза, мл/кг

Опыт

Контроль

«Ф

Настойка

0,62 18

1,25 16

2,5 18

5,0 17

10,0 18

1,25 16

2,5 16

5,0 18

10,0 18

15,0 18

-5,9

+24 женьшеня

Хабаровскоro ХФЗ сер. 08.87

Настойка.женьшеня

Хабаровскоr0 ХФЗ сер.10.84. 1

3

5

Контроль

И

6,52 (5,74-7,30)

4,03 (2,86-5,20)

5,86 (4,94-6,78)

6,48 (5,14-7,82)

7,02 (5,06-8,98)

5,63 (4,75-6,51) !

7,1 4 (5,65-8,63)

4,92 (3,90-5,94)

5,82 (4,91-6,73)

6,28 (4,94-7,62) 6,14 (4,95-7,33)

5,0 (3, 14-6,86)

7 91 (6,80-9,01)

9,78 (8,21-11,35)

10,96 (8>95-12,97)

5,88 (4,93-6,83)

6,72 (5,42.-8,02)

5,78 (4,11.-4,75)

8, 33 (7, 14- 9, 52)

9,52 (7,98-11,06) +35

+50,9

+56,1

+4,5

-5 9

+17,4

+43,2

+51,7 ъ0,05

)0,05 (0,05

à0,05

<0,05

>0,05

>0,05

>0,05 (О 05 (0>05

1712870

Табли ца4

С равнительная оценка точности метода-прототипа и предлагаемого метода хемилюминесценции

Препарат

Сухой остаток препарата, кк4 э

Й+м

Настойка женьшеня

0,0269+0,0075 11,2+28

0,05 2,64+0,27 59,Q9,3 0,001 Высокая

ee Oe.87 2 7

Настойка женьшеня хфз 10Я4

2,4

0,.023920,007 1,08+0,09

Низкая

Настойка аралии хфз 06 87

0 05 119М0,05 56, Ч..4:, 25 0,001 Высокая

°

0,0320+0,0065 12,5+19

3 2

Настойка аралии

Иф Об.с1.

0 ело.05

Низкая

2,8

О, 0279+0, 001

0,05. 2,2+0,1 38,6+8,9 О, 001 Высокая

6,3 о,0631+0,о06 -30и 7

8,2 0,081+0,005

1 35+0 18

Низкая

Составитель С.Рябов

Техред М.Моргентал

Корректор Н,Король

Редактор А.Лежнина

Заказ 533 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открь1тиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент™, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Экстракт элеутерококка ХФЯ

12.86

Экстракт элеутерококка "Санитас"

12.84

Сухой ос" таток препарата, г1мл, Й+м .

Различия между сухими остатками препаратов, Ф, Г1+м

Различия между npenapaTàèè по показателю К>, ь, Й+й

Адапто" генная актив-. ность