Способ выделения реакционных центров фотосистемы 2 растений

 

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений, а именно, к способам выделения, очистки и концентрирования ре-, акционных центров (РЦ) фотосистемы 2(ФС-2) растений. Целью изобретения является повышение выхода и чистоты препарата , а также сокращение времени анализа. Хроматографическое разделение, очистку и концентрирование проводят одновременно , причем в качестве хроматографического носителя используют 4-(бензоил-оксибис-) трифторметил(метил)-2,6-динитрофенилгидразин. иммобилизованный на агарозе. а элюирование РЦ ФС-2 проводят при концентрации NaCI, равной 170-180 мм. СО С

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<„53J „„1718754 Al (5t)s А 01 6 7/00

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕАКЦИОН НЫХ ЦЕНТРОВ ФОТОСИСТЕМЫ 2 РАСТЕНИ.Й (21) 4791471/13 (22) 14.02.90 (46) 15.03.92, Бюл. М 10 (71) Институт почвоведения и фотосинтеза (57) Изобретение относится к биохимии и

АН СССР физиологии растений, а именно, к способам (72) М. С, Христин, С. К. Жармухамедов, |;. выделения, очистки и конценгрирования ре-.

И. Аллахвердиев и B. В. Климов::. акционных центров (РЦ) фотосистемы

2(ФС-2) растений. Целью изобретения яв(53) 581.174.1(088.8) (56) Wldger W. R,. Cramer W. А., Hermqdsan ляется повышение выхода и чистоты препаM. and Неггвапп R. G., — FEBS Lett.,1986, v. рата, а также сокращение времени анализа.

191, р. 186-190;

Camm Е. R. and Green B; К вЂ” Journa1 of

cellular Blochemlstry, 1983, v. 23, р. 171-179.

Nanba О. and Sato К. — P.N.À.S, 1987, v. 84, р. 109-112.

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений, а именно к способам выделения. очистки и концентрирования реакционных,центров (РЦ) растений, и может быть использовано в исследованиях струк турно-функциональной организации РЦ фотосистемы 2 (ФС-2).

Известен способ выделения комплексаРЦ ФС-2, состоящего иэ пяти полипепти-дов: 47, 43, 32, 30 и 10кДа..

Известен способ выделения реакцион-" . ных центров. ФС-2. растений, заключающий- ся в двухкратном экстрагированйи хлоропластов 30 мМ октилглюкоэидом.в присутствии 2 мМ трис-МалеаТа с последующим центрифугированием второго. экстракта при 110000 g в течение 16 ч при.4 С в градиенте плотности сахароэы (10-30®), 1

Хроматографическое разделение, очистку и концентрирование проводят одновременйо, причем в качестве хроматографического носителя используют 4-(бензоил-оксибис-) трифторметил(метил)-2,6-динитрофенилги-дразин, иммобилиэованный на агарозе, а Б элюирование РЦ ФС-2 проводят при кон- у центрации NaCI, равной 170-180 мм. содержащей 30 мМ октилглюкозида, 0,75 М

ЭДТА и 2 мМ трис-Малеата (рН=8,0) .

Однако получаемый препарат не является РЦ, т,.е. он значительно загрязнен антенной (полипептид 47 кДа) и дает низкий (Л выход непосредственно по РЦ ФС-2 (белки,ф

Д-2, Д-1 и Ь559 не разрешаются при ПААГзлектрофорезе).

Наиболее близким техническим решением является способ выделения РЦ ФС-2 . растений, включающий солюбилизацию субхлоропластных фрагментов ФС-2 тритоном X-100, хроматографическое разделение супернатанта íà 0ЕАЕ-650$, промывку колонки 30 мМ NaCI и 0,2% тритоном Х- 100 для удаления основной массы (98%) сопутствующего хлорофилла, элюирование РЦ

ФС-2 110 мМ NaCl и последующую хрома1718754 тографическую доочистку и концентрирование препарата.

Недостатками способа являются.

Низкий выход РЦ ФС-2;

Из 50 мг (no хлорофиллу) исходных субхлоропластных фрагмемтов ФС-2 после первого хроматографировэмия получают всего 2 мл загрязненных разбавленных РЦ

ФС-2, т.е. 1,6-2,0 мг РЦ ФС-2 (по хлорофиллу).

Недостаточная чистота РЦ ФС-2, полученных после первого хроматографирования;

Необходимость последующих хроматогрэфических доочистки.и концентрирования.

Собранные после нескольких(как минимум трех) отдельных выделений, фракции

РЦ ФС-2 объединяют, разбавляют в 4 раза, наносят на ОЕАЕ-650$, промывают 2 ч 30. мМ NaCI и элюируют 110 мМ йаС1.

Даже после этого полученный препарат

РЦ ФС-2 загрязнен свободным сопутствующим хлорофиллом (количество хлорофилла а на РЦ составляет 5-6 молекул).

Способ требует значительных .затрат времени (около 30 ч), И, как следствие, полученные РЦ ФС-2 имеют низкую фотохимическую активность, обусловленную длительным временем выделения, недостаточной чистотой препарата. высоким отношением тритон

Х-100/хлорофилл. !

Цель изобретения — повышение выхода и чистоты препарата. а также сокращение времени анализа.

Поставленная цель достигается тем, что хроматографическое разделение, очистку.Ь концентрирование реакционных центров проводят одновременно, причем, в качестве хроматографического сорбента используют

4-(бензоилоксибис-(трифторметил)метил}2

6 -динитрофенилгидразин, иммобилизе. ванный нэ агарозе, а элюирование РЦ-2 проводят при концентрации NaCI, равной

170-180 мМ.

Известно, что соединение 4-1бвнзоилоксибис-(трифторметил)метил)-2,6-динитрофемилгидразин (N) используется в качестве гербицида или регулятора роста растений.

Нами экспериментально установлено. что соединение N, иммобилизовамное мэ агарозе, способно связывать только комплекс, состоящий из полипептидов Д;1, Д-2 и цитохрома bsss. т,е. РЦ ФС-2. . Полипептиды 47, 43 кДа, свободный хлорофилл и др. компоненты, .входящие в состав ФС-2, не связываются с соединением N.

10

Таким образом, при нанесении солюбилизовэнных компонент субслоропластных препаратов ФС-2 на колонку с иммобилизовэмным на агарозв соединением Й происходит и разделение, и одновременная очистка комплекса РЦ ФС-2, а также его концентрирование.

Абсорбировэнный ма колонке кОмплекс

РЦ ФС-2 элюируют 180 мМ NaCI..

Иммобилизацию соединения N на. агарозу проводят по известной методике.. При-. готовленный. сорбент вносят в .. хромэтогрэфическую колонку .(1х3 см) и уравновешивают 50 MM трис-HCI (pM7.2), 15 содержащим 0.05 тритона. Х-100 и 35 мМ

NaCI

П р и м в р 1, Подготовку солюбилиэированных компонент ФС -2 и хроматогрэфи-. рование солюбилизированного материала

20 проводят по известному способу за исклю. чением того..что в качестве хромэтографического носителя используют соединение N, иммобилизовэнмое на агароэе.

При нанесении нэ колонку смесь солю25 билизированмых компонент ФС-.2 контролируют нэ наличие РЦ ФС-2 по величине изменения йоглощения (Ь А) при 678 нм, связанного с фотооки ленивм хлорофилла

РЦ ФС-2 — Пщо до П ео в присутствии 5 мМ

30,силикомолибдэта натрия. На колонку наносят смесь солюбилизированных компонент

РЦ ФС-2 50 мг по хлорофиллу, содержащую

133.9 10 РЦ ФС-2. Затем колонку про. мывают проточным буфером в течение 1,5 ч

35 до получения практически бесцветного элюата. Выходящий из колонки элюат также кбнтролируют на наличие РЦ ФС-2 (Ь А

Паев). Далев колонку подвергают дейетвию линейного градиента NaO., причем нэчаль40 мая концентрация NaCI составляет 35 мМ.

При этом Элюируется всего одна хлорофиллсодержащая фракция и данная фракция проявляет фотохимическую активность, характерную для РЦ ФЦ-2.(Ь А Пэров), причем

45 элюировамив этой хлорофйллсодержащей фракции начинается йри концентрации

NaCI, равной 170 мМ, и достигает максимального значения при концентрации йаО, рабной 180 мМ.

50 С цеаью дальнейшей идентификации хлорофиллбелковей фракции измеряют спектр ее поглощения на спектрофотометрв, а также дифференциальный. спектр поглощения — на фосфороскопичвской

55 установке, S

Измеренные спектры поглощению и дифференциальный спектр, полученной предлагаемым способом фракции, хорошо совпадают со спектром РЦ ФС-2, 1718754

Пример 2. Одновременно для контроля нз.специфичность связывания РЦ Ф(-;2 с соединением . N проводят хромзтографирование смеси солюбилизированных компонент ФС-2 на агарозе Ges 5 соединения N.

Супернзтант солюбилизированных препаратов ФС-2 получают как в примере 1 и.наносят на колонну с активированной агарозой.без соединения N. Хроматографируют кзк в примере 1. При промывке промывочным буфером колонка отмывается полностью до совершенно бесцетных фракций.

Контроль на присутствие фотохимиче- 15 ской активности, характерной для РЦ ФС-2,. проводят как в примере 1. Элюат проявляет зктивность.по РЦ ФС-2, сравнимую количественно с активностью исходной смеси со-, любилизированных компонент РЦ ФС-2 до 20 хроматографирования, т.е. не происходит связывания никаких компонентов ФС-2, в т.ч. и реакционных центров ФС-2.

ll р и м е р 3. Для количественного сравнения известного и предлагаемого спо- 25 собов проводят выделение РЦ ФС-2.

Подготавливают солюбилизированные компоненты и проводят хроматографирование. После первого хроматографировзния на колонке с DEAE-650$ получают 30 фракцию РЦ ФС-2. содержащую дополнительные примеси свободного антенного хлорофилла. Соотношение хлорофилл/РЦ для этих препаратов составляет 8-10 молекул. Выход по РЦ ФС-2 составил 27ф. 35

Необходимо препарат доочистить и сконцентрировать. Для этого собирают фракции РЦ ФС-2, полученные после трех .отдельных выделений (первые три отдельных хроматографировзния). обьединяют их, 40 разбавляют и хроматографируют. Получен=.. ную фракцию РЦ ФС-2 используют для сравнительного. анализа предлагаемого и известного способов по компонентному со-. ставу; фотохимической активности и стз-. 45 бильности при хранении; выходу.РЦ ФС-2; " чистоте препарата; затратам времени:

Полипептидный состав комплексов РЦ

ФС-2, полученных известным и предлагаемым способами, определяют злектрофоре-. 50 тически в 12 ПААГ в присутствии 0,1 додецилсульфата натрия и 6 М мочевины,:

Полипептидный состав комплексов РЦ

ФС-2, полученных обоими способами, со-: вершенно идентичен и представлен пол- 55 ипептидами 32 кДа (Д-1), 30 кДа (Д.-2) и 10 кДа (апобелок цитохромз bssg).

Таким образом, и по спектру погаощения, и по дифференциальному спектру, и по. компонентному составу, препараты -РЦ ФСб

2, полученные известным и предлагаемым способами, идентичны, кроме содержания хлорофилла на 1 РЦ, Препараты РЦ ФС-2, полученные предлагаемым способом обладают фотохимической активностью — способны к фотоокислению Пщо и фотовосстановлению

Фео, чистота препаратов РЦ ФС-2 (величина обратная загрязненности молекулами свободного антенного хлорофилла) выше, среднее значение соотношения хлоро- филл/РЦ для предлагаемого способа составляет 4 молекулы, для известного — 5 молекул, Данные сравнительного анализа предлагаемого и известного способов по выходу

РЦ ФС-2 и данные по контролю на специфичность 4-(бенэиолоксибис-(трифторметил) метил)-2,6-ди нитр офен ил гидра зин а показывают, что в предлагаемом способе выход по реакционным центрам составляет

85,5, в известном способе — 63,1%, При использовании же агарозы,без 4-(бензоилокси бис-(трифторметил)метил)-2,6-ди нитрофенилгидразина выход по РЦ ФС-2 составляет 0%.

Следовательно, только 4-(бензоилоксибис-(трифторметил)метил)-2,6-динитрофенилгидраэин обладает специфичностью связывания по отношению к РЦ ФС-2.

За счет одновременного хроматографического разделения, очистки препарата и его концентрирования анализ удается провести за 5 ч 30 мин (в прототипе — 26 ч 30 мин).

Использование предлагаемого способа выделения РЦ ФС-2 по сравнению с известным обеспечивает следующие преимущества: выход РЦ ФС-2 составляет 85,5% (в прототипе — 63,1%); повышается чистота препарата РЦ ФС-2, а именно количество хлорофилла составляет 4 молекулы, в прототипе 5 молекул; анализ проводят в течение

5 «30 мин, в прототипе — 26 ч 30; как следствие сокращения времени выделения повышается способность сохранять фотохимическую активность, в зависимости от количества измерений и времени хранения при 4 С в течение серии измерений.

Кроме того, достигнуто значительное упрощение методики выделения (вместо 34 хроматографирований в прототипе — одно хроматографирование в предлагаемом способе); а также отпала необходимость в использовании дорогостоящих импортных химических реактивов.

Формула изобретения

Способ выделения реакционных центоов фотосистемы 2 растений. включающий

1718754

Составитель Л.Даркова

Редактор СЯатрушева Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Заказ 708 Тираж Подписное .

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 выделение хлоропластов, солюбилизировэние субхлоропластных фрагментов, нанесение субхлоропластных фрагментов на колонку с адсорбентом, промывку колонки и элюирование реакционных центров фото- 5 системы 2, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты препаpara, а также сокращения времени анализа, в качестве адсорбента используют 4-(бензоилокси бис-(трифторметил)метил)-2,6-динитрофенилгидразин, иммобилизованный на агарозе, а элюирование реакционных центров фотосистемы 2 осуществляют раствором NaCl с концентрацией 170-180 ммоль.