Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l.-продуцент моноклонального антитела, реагирующего с @ - субъединицей хорионического гонадотропного гормона человека и лютеинизирующего гормона человека

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Использование продуцируемых штаммов № ВСКК (П) 397Д моноклональных антител (МонАт) позволяет разрабатывать иммунологические способы определения уровня хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в биологических жидкостях организма для диагностики беременности у женщин на ранних сроках, диагностики хорионэпителиомы и других трофобластических опухолей, пика овуляции у женщин. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии X 63 Ад 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной официнальным препаратом хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). |3 качестве сливающего агента использован ПЭГ 1500. Селекция клеток проведена на; среде HAT, осуществлены 2 клонирования методом предельных разведений, получено 100% позитивных клонов. Условия выращивания штамма: среда.ЯРМ -1640с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота, температура 37°С, газовая фаза - воздух с 5% С.О2.-Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Через 10-20 дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши BALB/C, обработанной пристанем, получают асцитическую жидкость. С помощью высаливания сернокислым аммонием и последующей ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют около 7 мг иммуноглобулинов с содержанием. МонАт. продуцируемых штаммом, до 90%. МонАт реагируют , ХГЧ и ЛГЧ в разведении 1 мкг/мл в иммуноферментном и РИА тестах . Штамм депонирован в ВСКК (П) под № 397Д. ъ Ё 4 N3 О О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з " 12 Р. 21/08

ГОсудАРстВенный кОмитет

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 4

ЬЭ

О

1 (21) 4793878/13

{22) 20.02,90 (46) 23.03.92. Бюл. N. 11 (71) Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР (72) P.Ôèäëåð и М.Ш; Вербицкий (53) 578.085.23(088.8) (56) ЕР М О I32488; кл. А 61 К 39/395, 1985.

РЕ N 3507848, кл. С 12 N 5/00, 1986, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМ ЫХ КЛ ЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА, РЕАГИРУЮЩЕГО

CP -CVS1,E I4HI4ЦЕй ХОРИОНИЧЕСКОГО

ГОНАДОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА

И ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩЕГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА (67) Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Использование продуцируемых штаммов N ВСКК (Il) 397Д моноклональных антител (МонАт) позволяет разрабатывать иммунологическюе способы определения уровня хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в биологических жидкостях организма для диагностики беременности у женщин на ранних сроках, диагностики хорионзпителиомы и других трофобластических опухолей, пика овуляции у женщин. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии е

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки на основе продуцируемых штаммом моноклональных антител (МкАт) иммунологических способов определения цельной молекулы хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) или его изолированной Р -субьединицыф-ХГЧ) в биологических

„„5U „„-1721091 А1 г

Х 63 Ag 8.653 с клетками сел енки мыши линии BALB/Ñ, иммунизиров ной официнальным препаратом хориони ского гонадотропина человека (ХГЧ). В качестве сливающего агента использован ПЭГ.1500.

Селекция клеток проведена нэ среде НАТ. осуществлены 2 клонирования методом предельных разведений, получено 100 позитивных клонов. Условия выращивания штамма: среда. АРМИ 640 с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота, температура 37 С, газовая фаза — воздух с

5% СОг. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50 250 мл, посевная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Через

10-20 дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши BALB/Ñ, обработанной пристаном, получают асцитическую жидкость. С.помощью высаливания сернокислым аммонием и последующей ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют около 7 мг иммуноглобулинов с содержанием. МонАт, продуцируемых штаммом, до 90 . МонАт реагируютcP-ХГЧ, ХГЧ и ЛГЧ в разведении

1 мкг/мл в иммуноферментном и РИА тестах. Штамм депонирован в ВСКК (П) под М

397Д, жидкостях организма (кровь, моча, амниотическая жидкость и др,) с целью диагностики раннего срока беременности у женщин. диагностики трофобластических опухолей и наблюдения за ходом беременности у женщин из групп риска (невынашивание беременности, эктопическая беременность, гестоэы и др.), а также для определения

1721091 уровня ЛГ в крови в ИФА и РИА-тесте с целью диагностики пика ЛГ у женщин.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего МонАт. специфичные к

/3 -ХГЧ и Р -ЛГЧ, Штамм получают следующим образом, В качестве антигена используют официнальный препарат ХГЧ. Мышей линии

BALB/С иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в 1-й день — 500 ед. препарата в смеси с полным адьювантом

Фрейнда (ПАФ), на 14-й и 28-й дни вводят по 250 ед, препарата с ПАФ, реиммуниэируют мышь на 56-й день — вводят 2500 ед, ХГЧ в эабуференном физиологическом растворе хлоридэ натрия.

Через 72 — 96 ч реиммунизации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию клеток (спленоцитов). Клетки селезенки мыши BALB/С. иммунизированной препаратом ХГЧ, сливают (гибридизуют) с клетками мышиной миеломы Х 63 Ag 8.653.

Сливающий агент — ПЭГ 1500 (50 -ный раствор). Селекцию гибридных клеток проводят на среде НАТ, два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки), 100% позитивных клонов.

Стандартные условия выращивания: среда RPMI 1640 с 10 фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS), газовая фаза — воздух с 5 СО2. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток в 1 мл, кратность рассева 1:2, время культивирования 3-4 дня, В организме животного — мышь

BALB/Ñ, обработанная пристаном {0,5 мл в/брюшинно за 5-10 дней до инокуляции), доза инокуляции 3 — 8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Полученный штамм гибридных клеток мыши обозначен Ф 14. Штамм хранится в

Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток Всесоюзной коллекции клеточных культур под М ВСКК (П)

397 Д и характеризуется следующими признаками, Данные видовбй принадлежности: мышиные клетки линии BALB/С. Гибридома секретирует МкАт против Р -ХГЧ и Р-ЛГЧ, определяемые иммуноблоттингом, иммуноферментными, иммунофлуоресцентными и радиоимуниыми методами.

Контаминации, бактериями и грибами нет, микоплазмы не обнаружены. Штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела IgG1 класса, направленные противP ХГЧ иP ЛГЧ, специфичность оценивается иммуноблоттингом. иммуноферментными, иммунофлуоресцентными и радиоимунными методами. Концентрация полезного продукта МонАт против P ХГЧ в

5 культуральной среде около 10 мкг/MR, в асцитической жидкости около 7 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью иммуноферментного метода 1:3000 в культуральной среде и 2:(10 -10 ) в асци5

10 тической жидкости, при нанесении на плейты антигена в концентрации 30 ед./мл препарата ХГЧ; Продукция МкАт стабильна по крайней мере в течение 30 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гиб15 ридома перевивается на мышах BALB/С, Способ криоконсервации: 4х10 клеток

6 в RPMI 1640+ 10% FCS+ 10 ДМСО, замораживание в пенопластовой коробке при70 С. Жизнеспособность после

20 размораживания 70 — 907 (оценка жизнеспособности по исключению трипанового синего после 24 ч культивирования).

Штамм депонирован под % ВСКК (П)

397 Д.

25 При использовании гибридомы получены специфические к Р-ХГЧ и Р-ЛГЧ Монат путем выделения их из асцитической жидкости мыши BALB/С с помощью высаливания сульфатом аммония и последующей ионооб30 менной хроматографии на колонках с ДЕАЕ52 целлюлозой. Из 1 мл асцитической жидкости выделено 6,9 мг МкАт анти-P-ХГЧ.

Контроль на специфичность МонАт проведен в системе твердофазного иммунофер35 ментного анализа. МонАт реагируют с

Р-ХГЧ, цельной молекулой ХГЧ и ЛГЧ в разведении 1 мкг/мл. МкАт не реагируют с

ФСГЧ, ТТГЧ, а также с flI и ФСГ свиньи, коровы, лошади и ХГ лошади.

40 Пример 1. Продуцируемые штаммом

МонАт кр-ХГЧ использованы для разработ- ки системы твердофазного иммуноферментного анализа, в которой МонАт анти-Р-ХГЧ фиксировались (сорбировались) на пластин45 ках для иммунологических исследований . отечественного производства.

B качестве коньюгата МонАт с пероксидазой использованы МонАт к другому эпитопу Р-ХГЧ. Чувствительность 2-эпитопной

50 иммуноферментной системы на основе двух

МонАт к Р-ХГЧ 40-50 M Е/л. Эта тест-система позволяет выявлять ХГЧ в моче женщин, начиная с 8-10 дня после оплодотворения. т.е. обеспечивает раннюю диагностику бе55 ременности..

Пример 2, Продуцируемое штаммом

МонАт использовали также для разработки тест-системы твердофазного иммуноферментного анализа, в которой МонАт N. 397

1721091

Формула изобретения

Составитель Г.Игнатьева

Техред М.Моргентал Корректор Л.Патай

Редактор В.Петраш

Заказ 928 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Д против j3-ХГЧ и Р -ЛГЧ сорбировалось на пластинках для иммунологических исследований, а в.качестве коньюгата моноклональных антител с пероксидазой использованы антитела против-субьединицы ЛГЧ.

Чувствительность 2-эпитопной иммуноферментной системы 1ед/л ЛГЧ. Эта тест истема позволяет диагноз;тировать путем определения пика ЛГ период овуляции у женщин.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. ВСКК(П)

5 397Д вЂ” продуцент моноклонального антитела, реагирующего с j3-субъединицей хорионичес кого гон адотроп ного гормона человека и лютеинизирующего гормона человека.