Способ получения иммобилизованного коммерческого пепсина

 

Использование: фармацевтическая промышленность . Сущность изобретения: пепсин осаждают из ацетатного буфера с рН 3,9-4,5 раствором четыреххлористого титана из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 11/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4788247/13 (22) 19.12.89; (46) 30.04.92. Бюл. М 16 (71) Научно-производственное объединение

"Биомед" и Пермский научно-исследова.тельский институт вакцин и сывороток (72) Л,И.Райхер, И.И.Райхер, Н.Л.Фарцейгер, Е.В.Зотова, Ю.Г.Жуковский,: A,Ñ,Oíîрин и Е,В.Лехтцинд (53) 663.18 (088.8).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для промышленного получения препаратов иммобилизованного пепсина.

Известны способы двчхэтапной иммобилизации ферментов на гидроксидах переходных металлов, где в качестве носителя используют гидроксид металла, который получают при гидролизе соответствующего хлорида.

Недостатком этих способов является то, что в этих случаях иммобилизация фермента происходит преимущественно за счет адсорбции и не обеспечивается необходимая прочность связи с носителем как фермента, так и содержащегося в коммерческом пепсине группоспецифического фактора крови

"А + Н" (ГСФ). Такой иммобилизат не обеспечивает деконтаминации ферментируемого целевого продукта от группоспецифического фактора.

Цель изобретения — получение чистого целевого продукта за счет одноэтапного формирования прочного хелатного комп-. лекса гидроксида титана с иммобилизованным на нем пепсином и группоспецифическим фактором крови "А + Н", который

„„Я2, „1730148 А1 (56) Патент Великобритании М 1447751. кл, С 12 N 11/14, опублик. 1976. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО КОММЕРЧЕСКОГО ПЕПСИНА (57) Использование: фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: пепсин осаждают из ацетатного буфера с рН

3.9-4,5 раствором четыреххлористого титана из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина, 1 табл. не "сползает" с носителя при дальнейшем ферментолизе целевого продукта (антитоксических сывороток) и не загрязняет их.

Поставленная цель достигается тем, что к буферному раствору пепсина с концентрацией пепсина 8 мг/мл добавляют раствор соли четырехвалентного титана, образовавшийся осадок с иммобилиэованным пепсином и группоспецифическим фактором крови "А+ Н" отделяют и промывают буферным раствором, причем пепсин используют в.0,2 М ацетатном буферном растворе с рН

3,9-4,5 и добавляют раствор четыреххлористого титана из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина.

Пример1. К1000мл.0,2 M ацетатного буферного раствора (рН 4,15), содержащего препарат пепсина в концентрации 8 мг/мл, добавляют при постоянном перемешивании

100 мл 0,125 M кислого раствора четыреххлористого титана (на 1 мг препарата пепсина добавляют 1,56 мкмоль четыреххлористого титана). Оставляют при периодическом перемешивании на 4 ч, а затем беэ перемешивания — на 16 ч при комнатной темйературе. Образовавшийся осадок с иммобилизованными пепсином и группоспе1730148 цифическим фактором отделяют фильтрацией и промывают на фильтре 0,2 М ацетатным буферным раствором с рН 4,15. Выход целевого продукта 32 от исходного веса пепсина, Присутствие в готовом препарате 5 (антитоксической сыворотке) примеси ГСФ

"А+ Н" выявляют с помощью реакции тор.можения гемагглютинации — ОТГА. Аггл ютйнации в РТГА наблюдают во всех лунках, начиная с первой, 10

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что используют ацетатный буферный раствор с рН 3,9, Выход целевого продукта 30 . Результаты реакции торможения гемагглютинации, та- 15 кие же как в примере 1.

Пример 3, Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что используют ацетатный буферный раствор с рН 4,5..

Выход целевого продукта 31 . Результаты 20 реакции торможения геммаглютинации, такие же как в примере 1.

Пример 4, Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что к раствору пепсина добавляют 0,064 M раствор 25 четыреххлористого титана, т.е, на 1 мг препарата пепсина добавляют 0,8 мкмоль этой соли. Выход целевого продукта 31%. Результаты реакции торможения гемагглютинации такие же, как в примере 1. 30

П р и нее р 5, Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что добавляют 0,200 М раствор четыреххлористого титана, т.е. на 1 мг препарата пепсина добавляют 2,5 мкмоль этой соли. Выход целе-. 35 вого продукта 30, Реакция торможения гемагглютинации показывает отсутствие группоспецифического фактора.

Пример 6. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что исполь- 40 зуют ацетатный буферный раствор с рН 3,5, Выход целевого продукта 24 . Результаты

РТГА показывают отсутствие ГСФ.

Пример 7, Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что исполь- 45 зуют ацетатный буферный раствор с рН 5,0.

Выход целевого продукта 26, Результаты

РТГА показывают отсутствие ГСФ.

Пример 8. Выполняется аналогично примеру 1. за.исключением того, что добавляют 0.300 M раствор четыреххлористого титана. т.е. на 1 мг препарата пепсина добавляют 3,75 мкмоль этой соли, Выход целевого продукта 267. Результаты реакции РТГА показывают отсутствие ГСФ.

П р и м е.р 9. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что добавляют 0.030 M раствор четыреххлористого титана, т.е. на 1 мг препарата пепсина добавляют 0,375 мкмоль этой соли. Выход целевого продукта 30 . В реакции РТГА выявлен ГСФ.

Результаты проведенных опытов представлены в таблйце.

Из результатов, приведенных в таблице, следует.. что предлагаемый способ позволяет получать иммобилизованный пепсин, не вызывающий при его использовании в ферментолизе антитоксических сывороток, контаминации этих сывороток группоспецифическим фактором "А+ Н".

Предлагаемые диапазоны параметров выполнения способа являются оптимальными. Выход за эти параметры приводит или к уменьшению выхода целевого продукта (при отклонениях рН и повышении количеств четыреххлористого титана), или к появлению в конечном продукте — очищенной концентрированной антитоксической сыворотке — примесей группоспецифического фактора крови "А+ Н".

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного коммерческого пепсина, предусматриваю- . щий осаждение пепсина из буферного раствора раствором четыреххлористого титана с последующим отделением и промыванием осадка этим же буфером,.о т л и ч а ю щ и йс я тем, что. с целью повышения активности и чистоты целевого продукта за счет связывания группоспецифического фактора крови "А + Н". растворение коммерческого пепсина ведут в ацетатном буфере с рН 3,9—

4,5, а раствор четыреххлористого титана добавляют из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина. 1730148

Составитель И.Чаплина

Техред М.Моргентал Корректор В.Гирняк

Редактор М.Петрова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1489: Тираж .Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035; Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5