Способ получения гидропероксидов полиненасыщенных жирных кислот

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению биологически активных веществ - гидропероксидов полиненасыщенных жирных кислот (ПНМК). Цель изобретения - .увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ основан | на непрерывном пропускании со скоростью 0,5-15 л/мин раствора ПНЖК с концентрацией 0,01-0,25 ммоль/л через слой гранул модифицированного неорганического оксида (№10), на котором иммобилизована липоксигеназа, после чего следует концентрирование целевого продукта на гидрофобизированном силикагеле и элюирование его органическим растворителем средней или высокой полярности. Гранулы MHO имеют размер 0,1-0,25 мм, а количество липоксигеназы составляет 0,1-20 мг на 1 г MHO. Выход гидропероксида ПИЖК составляет 95-98% (по сравнению с 70-75% по известному способу). Упрощение способа достигается за счет непрерывности процесса, а также благодаря быстрому выделению целевого продукта. t

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BT0PCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4626056/13 (22) 22 ° 11.88 (46) 28.02.91. Бюл. - 8 (71) Институт биоорганической химии

АН УССР (72) И.А,Бутович, В.П.Кухарь, Е.В. Цысь и В.П.Бридня (53) 577.15(088.8) (56) Бутович И.А. и др. Иатериалы

6-ro Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. Вильнюс: 1988, ч. 2, с. 114. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОПЕРОКСИДОВ ПОЛИНЕИАС1Н 1ЕН1П1Х )КИРНИХ КИСЛОТ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ — гидропероксидов полиненасьш1енных жирных кислот (ПНЖК) . Цель изобретения— .увеличение выхода целевого продукта

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения гидропероксидов полиненасыщенных жирных кислот (1ПИКК), и может быть использовано в области биологии, медицины, сельского хозяйства, а также в качестве хроматографических стандартов для определения этих соединений в различных биологических объектах.

Цель изобретения — увеличение выхЬда целевого продукта и упрощение способа.

Способ заключается в пропускании разбавленного раствора ПНЖК через слой гранул модифицированного неор1 ганического сорбента, на котором им(S1)S С 12 Г 7/64, С 12 11 11/14

2 и упрощение способа. Способ основан на непрерывном пропускании со скоростью 0,5-15 л/мин раствора ПНЖК с концентрацией 0,01-0,25 ммоль/л через слой гранул модифицированного неорганического оксида (ГП10), на котором иммобилизована липоксигеназа, после чего следует концентрирование целевого продукта на гидрофобизированном силикагеле и элюирование его органическим растворителем средней или высокой полярности. Гранулы М1О имеют размер 0,1-0 25 мм, а количество липоксигеназы составляет 0,1-20 мг на 1 г МНО. Выход гидропероксида

ПНЖК составляет 95-98% (по сравнению с 70-75% по известному способу). Упрощение способа достигается за счет непрерывности процесса, а также благодаря быстрому выделению целевого продукта. мобилизован фермент липоксигеназа.

Эту операцию выполняют в щелочной среде, соответствующей наибольшей активности фермента. После этого полученный раствор направляют в следующую колонку, заполненную гидрофобизированным силикагелем, на котором целевой продукт-гидропероксид

ПНЖК концентрируется. Десорбцию гидропероксида ПНЖК выполняют небольшим количеством органического растворителя, в котором полученный продукт может .храниться.

Раствор ПНИК с концентрацией 0,010,25 мИ/л пропускают со скоростью

0,.5-15 мл/мин на 1 r оксида, а липоксигеназу в количестве 0,1-20 мг им1631086 мобилизуют на 1 r неорганического носителя с размером гранул 0,1-0,25 мм.

Использование данного способа позволяет упростить процесс, а также увеличить выход целевого продукта с

70-75 до 95-98Х.

Пример 1. В колонку объемом

0,3 см помещают 100 мг гранул "силохрома-С80" размером 0,125-0,16 мм, на которых иммобилизована липоксигеназа в количестве 0,3 мг. Через колонку, присоединенную к жидкостному насосу, пропускают раствор линолевой кислоты с концентрацией 0,1 мМ/л в

0,1 И натрий-боратном буфере (рИ 8,5).

Скорость пропускания раствора линолевой кислоты попдерживают постоянной и равной 5 мл/мин на 1 r оксида.

После этого полученный раствор прокачивают через вторую колонку, за полненную гидрофобизированным силикагелем, подсоединенную к выходу колонки с иммобилизованной липоксигеназой.

После прокачивания через колонки необходимого объема раствора ПИК колонку с силикагелем отсоединяют и промывают 3 мл метанола. Выход гидро.пероксида линолевой кислоты составляет 98Х, а степень чистоты, определенная УФ и ИК спектроскопией, составляет 95Х.

Пример 2. В колонку объемом

0,3 смз помещают 100 мг гранул "силохрома С 1,5" размером О, 1-0,25 мм, на которых иммобилизована липоксигеназа в количестве 2,0 мг, через колонку, присоединенную к жидкостному насосу, пропускают раствор арахидоновой кислоты (рН 9) с концентрацией

0,01 ммоль/л. Скорость пропускания

40 раствора арахидоновой кислоты поддерживают постоянной и равной 15 мл/мин на 1 г оксида.

Затем полученный раствор прокачиL вают- через колонку, заполненную гидрофобизированным силикагелем С18 и подсоединенную к выходу колонки с иммобилизованной липоксигеназой. После прокачивания через колонки необходимого объема раствора колонку с 50 гидрофобизированным силикагелем отсоединяют и промывают 5 мл этанола. Вы- . ход гидропероксида арахидоновой кисло, т составляет 98Х, а степень чистоты 96Х. 55

Пример 3. В колонку объемом

0,3 смз помещают 100 мг гранул "силохрома-С80" с размером О, 125-0, 16 мм, на которых иммобилизована липоксигеназа в количестве 0,01 мг. Через колонку, присоединенную к жидкостному насосу, пропускают раствор линолевой кислоты (рН 8,5) с концентрацией

0,25 ммоль/л. Скорость пропускания арахидоновой кислоты через колонку составляет 0,5 мл/мин на 1 г оксида.

° Затем полученный раствор прокачивают через колонку, заполненную гидрофобизированным силикагелем-С18, присоединенную к выходу колонки с иммобилизированной липоксигеназой.

После прокачивания через колонки необходимого объема раствора колонку с силикагелем отсоединяют и промывают

5 мл этанола. Выход гидропероксида линолевой кислоты равен 97Х, а степень чистоты 96Х.

Иммобилизацию липоксигеназы во всех примерах осуществляют по известным методам следующим образом.

Аминспропилсилохром в количестве

1 r, модифицированный глутаровым альдегидом, перемешивают с 10 мл раствора липоксигеназы с концентрацией

0,1-2,0 мг/мл в 0,1 И фосфатном буфере с рН 7,5 йри 4 С в течение

2-12 ч. После отделения осадка фильтрацией или центрифугированием с последующей отмывкой 100 мл буферного раствора с 0,5 М определяют степень иммобилизации белка, которая равняется 85-90Х.

Пример 4. Аналогичен примеру 1. Вместо "силохрома СЗО" используют широкопористую окись алюминия.

Выход 97Х °

Пример 5. Аналогичен приме, ру 1. Вместо "силохрома С80" используют широкопористый окисленный титан. Выход 94Х.

Пример 6. Аналогичен, примеру 1. Продукт синтеза вместо метанола элюируют этанолом, Выход 97Х.

Пример 7. Аналогичен примеру 1. Продукт синтеза вместо метанола элюируют ацетоном. Выход 96Х.

Пример 8. Аналоничен примеру 1. Продукт синтеза вместо метанола элюируют смесью диэтилоной эфир— гексан = i/1. Выход 96Х.

Таким образом, применение способа позволяет увеличить выход целевого продукта с 70-75 (по известному способу) до 95-98Х, а также упростить процесс получения целевого продукта. Упрощение сгособа достигает!

Составитель В. Муронец

Техред Л. Сердюкова Корректор А. Осауленко

Редактор М. Келемеш Заказ 524 Тираж 355 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10) 5 1С3 ся заменой гомогенного катализатора на гетерогенный благодаря которой: не требуется сложных процессов химического разделения катализатора и продукта, так как катализатор удаляется простым фильтрованием; количество катализатора легко регулировать в ходе синтеза; катализатор можно использовать многократно; синтез ведется в проточном режиме непрерывно, чем устраняется необходимость периодически останавливать реакцию для извлечения из реактора продуктов синтеза и введения новой порции исходных реагентов.

Предлагаемый способ позволяет отказаться от применения плительной и дорогостоящей процедуры хроматографической очистки конечного продукта, используемой в известном способе.

Формула изобретения

Способ получения гидропероксидов ,полиненасыщенных жирных кислот, вклю108б 6 чающий окисление полиненасыщенных

|жирных кислот в присутствии липоксн» геназы в качестве катализатора и по5 следующее вццеление целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения способа, окисление проводят в непрерывном режиме путем пропускания водного раствора полиненасыщенных жирных кислот. с концентрацией 0 01-0,25 мМ/л через гранулы модифицированного неор- ганичекого оксида размером 0, 1-0,25 мм со скоростью 0,5-15 мл/мин на 1 r оксида, содержащих 0,1-20,0 мг липоксигеназы на 1 г оксида, а выде-ление целевого продукта проводят гропусканием полученного раствора через

20 слой гидрофобизированного силикагеля с последующим элюированием органическими растворителями средней и высокой полярности.