Способ определения естественной киллерной активности клеток

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения естественной киллерной активности клеток Цель изобретения - упрощение способа У обследованного берут кровь, выделяют лимфоциты , инкубируют их с лимфоцитами, обработанными фитогемагглютинином, и по уровню включения ЗН-тимидина выявляют естественную киллярную активность. По сравнению с известным способом упрощается методика постановки исследования, так как отпадает необходимость в введении серийных пассажей перевиваемых культур.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ы

С

С

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4685809/14 (22) 26.04.89 (46) 30.04.92. Бюл. N 16 (71) Киргизский государственный медицинский институт (72) В.Л.Морозов. Д.А.Адамбеков и

Д.Б. Ба ш кое в (53) 615.375(088.8) (56) Кузнецов В,А„Ившина А,В., Кадагидзе

З,Г. Иммунология, 1988, N 5, с. 27 — 30, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ КИЛЛЕPНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клийической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы.

Цель изобретения — упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

К 10 мл гепаринизиров;;нной крови из вены (25 ед/мл) добавляют 1 мл 10%-ной желатины и инкубируют 35 мин при 37 С до оседания эритроцитов. Взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколла-верографина плотностью 1,077 и центрифугируют 45 мин при 450 g, Отсасывают интерфазу (мононуклеары), дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют в полной питательной среде (ППС), состоящей из среды RPM1/1640 с добавлением

1-глютамина (300 мг/мл), 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 0,08 мг/мл гентамицина, Клетки разводят до концентрации 2 10 /мл. В пять лунок пластиковых

„„Я2„„1730592 А1 (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения естественной киллерной активности клеток.

Цель изобретения — упрощение способа. Y обследованного берут кровь, выделяют лимфоциты, инкубируют их с лимфоцитами, обработанными фитогемагглютинином, и по уровню включения ЗН-тимидина выявляют естественную киллярную активность. По сравнению с известным способом упрощается методика постановки исследования, так как отпадает необходимость в введении серийных пассажей перевиваемых культур. плоскодонных планшетов помещают по 0,1 мл взвеси клеток, B две лунки добавляют по

0,1 мл фитогепагглютинина (ФГА) в разведении 1:100 на ППС, в остальные лунки — 0,1 мл ППС. Планшеты инкубируют 48 ч при

37 С в атмосфере 5%-ного углекислого газа.

Затем планшеты центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают и отмывают клетки один раз средой 199, Во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС, клетки ресуспендируют, Культивированные клетки смешивают следующим образом.

1 (опыт), К нестимулированным лимфоцитам добавляют стимулированные ФГАлимфоциты (бласты);

2 (контроль 1). К стимулированным лимфоцитам добавляют 0,1 мл ППС;

3 (контроль 2), К нестимулирован н ым лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты.

Планшеты инкубируют еще 18 ч, после чего во все лунки добавляют Н-тимидин (1мкм Cu), инкубируют 4 ч, клетки переносят на фильтры и после общепринятой обрабо1730592 тки определяют уровнеь радиоактивности на бета-счетчике.

Расчет результатов проводят по формуле

1

t

1

Составитель B,Ëèòoe÷åíêo

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М,Бланар

Редактор М,Петрова

Заказ 1511 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,-4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

K> — О

К1 К2 где Π— число импульсов в опытной пробе;

K1 — число импульсов в пером контроле;

Кг — число импульсов во втором контроле.

Пример 1. Больной Г., 36 лет. Диагноз: инфильтративный туберкулез легких, БК+.

20,03.89, Из вены больного :взято 10 мл крови, добавлено 250 ед, гепарина и 1 мл

10% íîé желатины, Кровь инкубируют 35 мин, затем взвесь лейкоцитов в плазме наслаивают на градиент фиколл-верографина и центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин, Отсасывают интерфазу, дважды отмывают клетки средой 199 и суспендируют клетки в полной питательной среде (ППС), Клетки разводят до концентрации 2 106/мл. В пять лунок пластикового планшета помещают по

0,1 мл взвеси клеток. В две лунки добавляют по 0,1 мл ФГА (ОИсо Р) в разведении 1;100, в остальные лунки — по 0,1 мл ППС. Планшет инкубируют 48 ч при 37 С в атмосфере 5%ного углкислого газа. Планшет отцентрифугировали. Затем клетки отмывают один раз средой 199, во все лунки добавляют по 0,1 мл ППС и клетки ресуспендируют. Далее проводят смешивание клеток: к нестимулиl рованным лимфоцитам добавляют стимулированные лимфоциТы (бласты) — опыт, к стимулированным лимфоцитам добавляют

0,1 мл ППС (контроль )), к нестимулированным лимфоцитам добавляют нестимулированные лимфоциты (i<îíòðoëü 2). Планшет инкубируют еще 18 ч при тех же условиях.

За 4 ч до окончания инкубации во все лунки вносят 1 мкКи Н-тимидина. Ресуспендированную клеточную взвесь переносят на бумажные фильтры размером 2х2 см, Фильтры высушивают в течение 1 сут при комнатной температуре, помещают в стек5 лянный сосуд и отмывают дважды, 0,9%ным раствором хлористого натрия по 5 мин и 5%-ной трихлоруксусной кислотой в течение 1 сут при 4 С, Затем промывают еще двукратно 5%-ной трихлоруксусной кисло10 той по 5 мин и фиксируют 96-ным спиртом 2 мин, высушивают, помещают в 5 мл сцинтиллятора (PPO-РОРОP-толуол) и просчитывают на жидкостном сцинтилляционном спектрофотометре (1 КВ, Швеция). Резуль15 таты регистрируют по числу импульсов в 1 мин, Получены следующие показатели: опыт — 6728; контроль 1 — 15713; контроль 2—

5127, 20 15713 — 6728

Pac e : 15713 — 5127 100 = 84,88 %, Предлагаемый способ прост, так как отпадает необходимость в постоянных пересевах клеток, как это делается в известном

25 способе поддерживания жизнеспособности опухолевых линий клеток, В связи с этим уменьшается время выполнения анализа и исключается использование полных питательных сред, что дает

30 значительный зкономический эффект.

Формула изобретения

Способ определения естественной киллерной активности клеток, включающий инкубацию лимфоцитов с мечеными

35 клетками-мишенями с последующим определением уровня радиоактивности, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве клеток-мишеней используют лимфоциты, обработанные фитоге40 магглютинином, а естественную киллерную активность определяют по уровню включения радиоактивного меченого Н-тимидина. з