Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к глиальному фибриллярному кислому белку человека

 

Область применения: иммуноморфологическая диагностика опухолей центральной и периферической нервной системы человека. Сущность изобретения: получение МКА, обладающих повышенной специфичностью к ГФКБ. Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы РЗ- Х63. Ад8.653. Среда для культивирования: RPM1 1640, содержащая 10% ЭТС и 5 меркаптоэтанола. Клетки культивируют в монослое (5 10 - 5 10 кл/мл), время субкультивирования 48 ч. Штамм стабильно продуцирует МКА в течение 25 пассажей in vitro и 5 пассажей in vivo. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 70 мкг/мл, в асцитной 5-7 мг/мл. МКА специфически взаимодействуют с ГФКБ человека, не реагируя с антигенами нейронов и эндотелием сосудов головного мозга. ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок человека, МКА - моноклональные антитела, ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка. 2 табл. со с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4863385/13 (22) 25.07.90 (46) 15.04.92. Бюл. М 14 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт "Биотехнология" и Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена (72) P.Ã.Âàñèëoâ, И.Ю.Втюрина и Л,В.Литвинова (53) 578.085.23(088.8) (56) Virtanen 1., Partanen P., Viettinen М. and

Lehto V.— P. Antibodies to intermediate

filaments in diagnostic histopathology—

International clinical products review

November, 1983. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЪ|Й ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

М О Н О КЛ О Н АЛ Ь Н Ы Х АНТИТЕЛ К ГЛ И-.

АЛЬНОМУ ФИБРИЛЛЯРНОМУ КИСЛОМУ

БЕЛКУ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики опухолей центральной .и периферической нервной системы человека.

Известны коммерческие моноклональные антитела (МКА) и ГФКБ производства фирмы 1.absystems.

Недостатком известных МКА можно считать реакцию с эндотелием сосудов как проявление неспецифического взаимодействия и неравномерное окрашивание глиальных клеток мозга и клеток глиом при работе на серийных срезах.

„„. Ы„„1726512 А1 (st)s С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. (57) Область применения; иммуноморфологическая диагностика опухолей центральной и периферической нервной системы человека, Сущность изобретения: получение МКА, обладающих повышенной специфичностью к ГФКБ. Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/с с клетками миеломы РЗ—

Х63. Ag8.653. Среда для культивирования:

RPM1 1640, содержащая 10% ЭТС и 5 10 M меркаптоэтанола. Клетки культивируют в монослое (5 10 — 5 10 кл/мл), время субкультивирования 48 ч. Штамм стабильно продуцирует МКА в течение 25 пассажей in

vitro и 5 пассажей in vivo, Концентрация М КА в культуральной жидкости составляет 70 мкг/мл, в асцитной 5 — 7 мг/мл. МКА специфи- З чески взаимодействуют с ГФКБ человека, не реагируя с антигенами нейронов и эндотелием сосудов головного мозга. ГФКБ — глиальный фибриллярный кислый белок человека, МКА — моноклональные антитела, ЭТС вЂ” эмбриональная телячья сыворотка. 2 табл.

Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток мыши линии BALB/с, продуцирующих MKA повышенной специфичности по отношению к

ГФКБ человека, которые могут быть использованы для иммуноморфологической диагностики опухолей центральной и периферической нервной системы глиального происхождения на криостатных срезах.

Штамм получают следующим образом.

Иммунизация, Для иммунизации отбирают группу из 6-8 здоровых мышей линии

BALB/с и каждую мышь метят индивиду1726512

15

30

40

55 ально. В качестве антигена используют очищенный ГФКБ (10 мкг/мл), разлитый аликвотами по 50 мкл и хранившийся при(-20) С.

Все иммунизации проводят с интервалом в 13 дней, Через 10 дней после 2-ой иммунизации отбирают кровь из ретроорбитального синуса мыши с помощью силиконированного капилляра. Полученную сыворотку исследуют на присутствие специфических антител иммуноферментным методом. На 13-й день после последней иммунизации мышей, в сыворотках которых обнаруживается наибольший титр антител к

ГФКБ, готовят к гибридизации.

Гибридизация. Клетки селезенки иммунных мышей, полученные на 13-й день после завершающего введения антигена, сливают с клетками мышиной миеломы РЗ—

Х63, Ag 8.653 с помощью 50%-ного полиэтиленгликоля мол. мас,4000. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5;1, После гибридизации клетки высевают в 24-луночные панели (по 5 х 10 клеток на каждую лунку), в которые предварительно высевают пеоитонеальные макрофаги мыши (по 5 х

«10 клеток на лунку). Селекцию гибридом проводят в полной среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% оленьей сыворотки, 200 мМ

L-глутамина, 5 х 10 М 2-меркаптоэтанола, 10 М гипоксантина, 4 х 10 М аминоптерина и 1,6 х 10 М тимидина.

Скрининг. гибридом, определение содержания МКА в культуральной жидкости гибридом методом иммуноферментного анализа (ИФА) и выявление ГФКБ на криостатных срезах тканей человека.

Для проведения ИФА в 96-луночных панелях для микротитрования из поливинилхлорида (ПВХ) адсорбировали раствор

ГФКБ в карбонатно-бикарбонатном буфере, 0,05 М, рН 9,6 (по 50 мкл на лунку) и инкубировали в течение ночи при 4 С. По истечении времени инкубирования лунки блокировали 0,5%-ным раствором желатины в ЗФР при 37 С 40 мин с последующим отмыванием раствором ЗФР/0,05% твин20. Культуральные жидкости гибридом вносили в лунки панелей. покрытых ГФКБ (каждое разведение в 2 лунки). B качестве положительного контроля использовали мышиную антисыворотку (разведение 1 .10000), а в качестве отрицательного контроля — супернатант миеломы РЗ вЂ” Х63 Ag 8653, После инкубации 1 ч при 37 С пластины трижды отмывали ЗФР/твин-20 и добавляли высокоспецифичные антитела кролика к иммуноглобулинам мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена, и инкубировали пластины еще 40 мин при 37 С, После 3кратного отмывания пластин ЗФР/твин-20 в лунки добавляли 0,04%-ный раствор 0-фенилендиамина в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,0 с добавлением 0 012% перекиси водорода. После развития окраски реакцию останавливали раствором 2 н. серной кислоты. Спектрофотометрическое определение проводили при 492 нм.

Для проведения иммуноморфологической реакции готовят криостатные срезы ткани головного мозга человека (мост, мозжечок, кора и белое вещество больших полушарий), взятого при аутопсии через 6 ч после смерти больного от острого кровотечения, а также срезы молочной железы, ко-. жи и желудка (используют материал, удаленный хирургическим путем), Кусочки тканей замораживали в жидком азоте. Криостатные срезы толщиной 5 — 6 мкм высушивали 3 мин на воздухе, либо фиксировали в

4%-ном забуференном растворе формалина, рН 7,3, Культуральные среду из ИФА-положительных лунок наносили на тканевые срезы и инкубировали 2 ч при комнатной температуре или при (-4) С 16 ч; затем срезы промывали (по 5 мин) в 3 сменах забуференного физиологического раствора, рН 7,3, а затем инкубировали с антисывороткой к иммуноглобулинам мыши, меченным ФИТЦ или пероксидазой. Результаты реакции учитывали в люминесцентном или световом микроскопе в зависимости от природы используемой метки. Для клонирования отбирали гибридомы, которые продуцируют

МКА, взаимодействующие с глиальными клетками в виде четкого фибриллярного свечения и не дающие реакций с другими клеточно-тканевыми структурами.

Клонирование отобранных гибридом.

Культуры гибридом, в супернатантах которых обнаруживаются антитела к ГФКБ, не дающие перекрестных реакций с другими тканевыми антигенами человека, клонировали методом предельных разведений из расчета 0,3 клетки на лунку в среде RPMI

1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 200 мМ глутамина, 5 х 10 М 2-меркаптоэтанола в присутствии гипоксантина (10 М) и тимидина (1,5 х 10 М). В результате клонирования позитивных первичных гибридом культуры сохранили способность стабильно продуцировать антитела заданной специфичности.

Изотипспецифический анализ надосадочных жидкостей клонированных гибридом показал, что все 20 полученных гибридом п родуци руют Ig G I.

Получение MKA in vivo, Для получения асцита мыши линии BALB/c (самки 12—

14-недельного возраста) были примированы

1726512 пристаном по 0,5 мл внутрибрюшинно за 10 дней до прививки гибридных клеток. Клетки гибридом, отмытые средой R P M I 1640, вводили внутрибрюшинно по 2 х 10 клеток на

6 мышь. Время образования асцита 14 — 20 дней; МКА в асцитной жидкости 2 — 10 мг/мл.

Полученный штамм гибридных культивируемых клеток хранится в Специализированной коллекцли перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером BCKK (II) 421Д и характеризуется следующими признаками, Культуральные свойства, Клетки культивируют в монослое в концентрации 5 х 10

6 — 10 кл/мл, время субкультивирования около 48 ч. Среда для культивирования RPM1

1640 содержит 10% ЭТС и 5 х 10 М 2-меркаптоэтанола. Число пассажей к моменту депонирования 25, Характеристика моноклональных антител. МКА относятся к ц 61 н, Они высокоспецифичны по отношению к кислому глиальному фибриллярному белку человека.

Для оценки специфичности МКА используют непрямой вариант иммуноморфологического метода с исследованием нормальных (кожа, молочная железа, щитовидная железа, матка, яичник, печень, надпочечник; легкое, желудок, головной мозг) и опухолевых тканей. различного гистогенеза и локализации (рак молочной железы, яичников, эндометрия, желудка и легкого, синовиальная саркома. рабдомиосаркома, эпителиоидная саркома. нейрофиброма, фибриллярная астроцитома, глиобластома, аденома гипофиза,менингиома).

Продуктивность штамма. Концентрация МКА в культуральной жидкости 70 мкгlмл, а в асцитной 5 — 7 мг/мл, Стабильность продукции МКА сохраняется на протяжении 25 пассажей in vitro и 5 пассажей

in vivo, Криоконсервирование, Криоконсервирование гибридомы проводят в ЭТС, содержащей 15% ДМСО, Первые 3 сут ампулы с клетками хранят при (-70)"С. затем переносят в жидкий азот. Жизнеспособность гибридом оценивают путем подсчета клеток при окрашивании 0,5%-ным раствором трипакового синего, Жизнеспособность около

80%, 5 Моноклональные антитела выделяют из асцитной жидкости с помощью. сульфата аммония и последующей хроматографии на

ДЭАЭ-целлюлозе. Гомоген.ность выделенных МКА проверяют путем электрофореза в

10 полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, Пример 1. Кусочки ткани головного мозга, полученные через 6 ч после смерти больного от острого кровотечения, и кусоч15 ки опухоли головного мозга (фибриллярная астроцитома, глиобластома), а также нейрофибромы и хемодектомы, полученные при операции, замораживают в жидком азоте.

Срезы толщиной 5 мкм готовят на криоста20 те, фиксируют 3 мин в 4 /,-ном формалине на забуференном фосфатным буфером физиологическом растворе, рН 7,3. отмывают в 3 сменах 3ФР по 20 мин каждая. На срезы наносят МКА к ГФКБ, инкубируют 1 ч, затем

25 срезы отмывают в ЗФР и наносят антитела к иммуноглобулинам мыши. меченные пероксидазой. Инкубируют 1 ч, затем срезы отмывают в ЗФР и добавляют субстрат диаминобензидин (ДАБ) совместно с пере30 кисью водорода на 15 мин, Контроль реакции — 1-ая инкубация с культуральной средой вместо МКА, Препараты исследуют в световом микроскопе. Положительная реакция развивается в астроглии и ее отростках.

35 Эндотелий сосудов и межклеточный матрикс с МКА не взаимодействует, Результаты исследований представлены в табл.1 и 2.

Данные табл,1 и 2 свидетельствуют о том, что полученные МКА специфически вза40 имодействуют с ГФКБ человека. не реагируя с антигенами нейронов и эндотелием сосудов головного мозга.

Формула изобретения

45 Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus ВСКК (1!) 421Д. используемый для получения моноклональных антител к глиальному фибриллярному кислому белку человека.

1726512

Таблица 1

Специфичность МКА к глиальному фибриллярному кислому белку человека, определенных методом непрямой иммуноморфологии на криостатных срезах различных органов и тканей человека

О ганы и ткани человека

Взаимо ействие МКА

Мозг: астроглия нейроны сосуды

Щитовидная железа

Поджелудочная железа

Печень

Слюнные железы

Легкое

Почки

Яичник

Матка: миометрий эндометрий

Желудок

Надпочечники

Селезенка

Кожа: эпидермис потовые и сальные железы

Молочная железа

Попе ечно — полосатые мышцы

Таблица 2

Взаимодействие МКА

On хали

Опухоли центральной нервной системы (головного мозга ): глиома глиобластома медуллобластома менингиома аденома гипофиза

Опухоли периферической нервной системы (опухоли мягких тканей нейроэктодермального генеза ); нейрофиброма нейробластома хемодектома

Опухоли мягких тканей другого гистогенеза: синовиальная саркома меланома кожи меланома глаза круглоклеточная саркома абдоиса кома

Специфичность МКА к глиальному фибриллярному кислому белку, определенных методом непрямой иммуноморфологии на криостатных срезах опухолей человека различного гистогинеза

1726512

Продолжение табл. 2

П р и ме ч а н и е: "+" — положительная реакция; "—" — отсутствие реакции

15

25

35

Составитель P.Âàñèëîâ

Техред М.Моргентал Корректор Н.Король

Редактор Н,Горват

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1249 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5