Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи

 

Использование: штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. BCKK (П) № 420. продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, используемый для количественного определения инсулина с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или иммуноблоттинга. Сущность изобретения: получение МКА с повышенной константой аффинности к инсулину. Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы Sp2/0. Среда для культивирования: D MEM с 10% СПК. Схема пассирования:.один раз в течение 4-5 дней in vitro. В виде асцита клетки перевивают в течение 8-10 пассажей . Концентрация МКА в культуральной жидкости на 7-й день культивирования составляет 40 мкг/мл, а в асцитной - 5-8 мг/мл. С помощью ИФА при использовании полученных МКА выявляют 30 пкг гормона/мл .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4855424/13 (22) 31.07.90

° (46) 15.04,92. Бюл. N 14 (71) Институт биохимии им, А.Н.Баха (72) Т.В.Чередникова, М.В.Демчева, А.П.Савицкий и Н.В.Носыркова (53) 578.085.23(088.8) (56) Ratjen 0.А., Underwood P,А. Identification of antigenic determinants of insulin, recognIzed by monoclonal antibodies — Мо!

Immunology, 1986, v. 23 (4), рр.401 — 405, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕMblX КЛЕТОК MUS MUSCULUS I„, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ КОБЩИМ

АНТИГЕННЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СВИНЬИ (57) Использование; штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. ВСКК (П) % 420, продуцирующий моноклональные

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения инсулина.

Известно большое количество гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к инсулину, Однако значительная часть гибридом синтезирует моноклональные антитела к инсулину быка, которые со значительно меньшим сродством взаимодействуют с инсулином человека, или к инсулину человека, которые менее эффективно взаимодействуют с гормоном другой видовой принадлежности. Наиболее широко используют инсулин свиньи. Это обусловлено тем, что инсулин свиньи отличается от инсулина человека только одним аминокислотным остатком, что снижает вероятность побочных реакций при терапев-. тическом лечении.

Я2 1726511 А1 (st)s С 12 -N 5/00, С 12 P 21/08 антитела (MKA) к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, используемый для. количественного определения инсулина с"помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или иммуноблоттинга. Сущность изобретения: получение МКА с повышенной константой аффинности к инсулину; Штамм получают в результате гибридизации спленоцитов Mbl шей линии Balb/с с клетками миеломы

Sp2/О, Среда для культивирования: 0 MEM с 10% СПК. Схема пассирования: один раз в течение 4 — 5 дней in vitro. В виде асцита клетки перевивают в течение 8-10 пассажей. Концентрация МКА в культуральной . жидкости на 7-й день культивирования составляет 40 мкг/мл, а в асцитной — 5-8 мг/мл. С помощью ИФА при использовании полученных МКА выявляют 30 пкг гормона/мл.

Поэтому для иммунодиагностики, а также регулярного определения концентраций инсулина необходимы препараты моноклональных антител, способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека.

Наиболее близок к предложенному штамм гибридных клеток, синтезирующий моноклональные антитела к инсулину свиньи (1), обозначенный как 5Н. 18. 10D.

Однако данные антитела не взаимодействуют с инсулином человека.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, используемого для получения моноклональных антител с более высокой константой афинности, взаимодействующих с инсулином человека, на основе которых мо1726511 жет быть создан высокочувствительный диагностикум для определения инсулина.

Штамм получают следующим образом.

В качестве иммуногена используют препарат инсулина свиньи. 4-недельных мышей линии Balb/с иммунизируют в течение месяца 3 раза 30 мкг инсулина. При первой инъекции раствор инсулина суспендируют в равном объеме адъюванта Фрейнда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA, 1:15000, За четыре дня до слияния мышей иммунизируют раствором инсулина в физиологическом растворе, Через 4 дня у мыши в стерильных условиях извлекают селезенку, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем 10 глюкозы, и оставляют стоять 3 мин. Грубый осадок отбрасывают а взвесь клеток переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800 об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора. Повторно центрифугируют в тех же условиях, Эту операцию повторяют дважды, Аналогичным образом трижды промывают физиологическим раствором клетки миеломы линии Sp2/О. затем спленоциты смешивают с клетками миеломы в соотношении 10;1 и осаждают центрифугированием, Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл

50 -ного полизтиленгликоля в физиологическом растворе, содержащего 10 диметилсульфоксида. Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема

50 мл, Клетки осаждают центрифугированием и осадок суспендируют,в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ), содержащий 10 сыворотки плода коровы (СПК) скота, 3,5 мМ глутамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптозтанола, 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина, 0,4 мкМ аминоптеринэ. Клетки распределяют в пяти 96-луночных панелях для микротитрования (Dynatech) и культивируют в C0z-термостате при 37 С и содержании в атмосфере 5 СОг. Через 5 дней клетки подкармливают, убирая из каждой лунки 50 мкл среды и добавляя 50 мкл свежей, Через 2 недели после начала слияния тестируют культуральную жидкость на моноклональные антитела методом ELISA, Гибридомы, положительные по результатам тестирования, помещали в среду, содержащую все указанные компоненты, за исключением аминоптерина (НТ-среда).

Клетки наращивают в 24-луночных панелях для микротитрования. часть клеток замораживают, а остальные трижды клонируют в полужидком агаре, Клонирование гибридомы повторяли трижды, Клонированную гибридому 6Е 6G 2А перевивают на мышах

5 Balb/с для получения асцитной жидкости.

Полученный штамм гибридных клеток продуцирующий моноклональные антитела к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи, депонирован в спе10 циализированой коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под N ВСКК (П) 420 Д и характеризуется следующими признаками.

15 Культуральные свойства. Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон с 3 мл среды DMEM, содержащей 10 СПК, 3,5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натрия и 50 мМ 2-меркэп20 тозтанола, засевают 250000 клеток гибридомы 6Е, 6G. 2А и проводят пассирования 1 раз в 4 — 5 дней с подсчетом клеток. Для получения асцита мышам BALB/с за 7 дней во введения гибридомных клеток в/б вводят

25 0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентадекана. На

7 день животным в/б инъецируют по 500000 клеток, Асцитную жидкость собирают на 1214 день, Объем асцита 5 — 6 мл. Клетки из асцита перевивают в течение 8-10 пассажей

30 без заметного изменения титра моноклональных антител в асцитной жидкости.

Характеристика полезного продукта, Моноклональные антитела относятся к

IgG2a. Константа аффинности 4х10 o M

35 Кэриологическая характеристика штамма: Модальное число хромосом 80. Маркерных хромосом не выявлено.

Продуктивность штамма. Концентрация моноклонэльных антител в культурэльной

40 жидкости на 7-ой день культивирования 40 мкгlмл в асцитной жидкости 5-8 мг/мл при определении по методу Лоури и п помощлю

ELI SA.

Криоконсервирование. Клетки штамма

45 ресуспендируют в смеси, содержащей 10 /

ДМСО, 30 СПК и 60 среды ДМЕМ, в концентрации 1х60 клеток на 1 мл. разли6 вают при 4 С в пластиковые ампулы, помещают в полиуретановые контейнеры и

50 переносят в холодильник (-70)"С на 18 ч.

Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживают при

37 С в водяной бане. Жизнеспособность клеток оценивают путем окрашивания три55 пановым синим: она составляет 60 .

Контаминация. При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен, Пример 1. Моноклональные антитела используют для определения концентрации

1726511 инсулина методом иммуноферментного анализа. В 96-луночные полистироловые панели для микротитрования помещают 100 мкл (10 мкг/мл) раствора моноклональных антител в 0,1 М карбонатном буфере, рН

9,0, и инкубируют 2 ч, Затем в каждую лунку добавляют 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в том же буфере и инкубируют

2 ч. Лунки промывают 0,015 М фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,05 твин-20 (Ф БТ). К адсорбированным

-на полистироле моноклональным антителам добавляют 100 мкл раствора, содержащего исследуемый образец инсулина и конъюгат инсулина с ковалентно пришитой

15 к нему пероксидазой в ФБТ, В контрольные лунки помещают аналогичный образец, но

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscuius L. ВСКК (П) N 420Д, используемый для получения моноклональных антител к общим антигенным детерминантам инсулина человека и свиньи.

Составитель Т,Чередникова

Техред M,Ìoðãåíòàë Корректор Н,Король

Редактор Н.Горват

Заказ 1249 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 не содержащий инсулин. Инкубируют 1 ч при 37 С. Промывают ФБТ и добавляют в каждую лунку субстратную смесь: 0,03 20

Н20г, 2 мМ ABTS (2,2-азинодиэтилбензотиозолин-6)-сульфоновая кислота, 0,05М цитратный буфер рН 4,0. Оптическую плотность определяют при 412 нм на специальном автоматическом устройстве, Концентрацию 25 инсулина вычисляют по построенной в параллельном эксперименте калибровочной кривой, полученной как описано выше, добавляя в лунки панелей известные концентрации инсулина. 30

Чувствительность определения инсулина 30 пкг гормонаlмл. Специфичность взаимодействия моноклональныхантител c инсулином оценивают методом конкурентного иммуноферментного анализа в следу- 35 ющей системе, К моноклональным антителам, адсорбированным на полистироле, добавляют инсулин свиньи, меченный пероксидазой, а также немеченый инсулин человека и быка. Специфичность 40 моноклональных антител оценивают по проценту ингибирования связывания конъюгата инсулин-пероксидаза, немеченым инсулином свиньи в качестве конкурирующего агента.

Моноклональные антитела 6Е.6G.2А одинаково эффективно взаимодействуют с инсулином человека и свиньи, однако для ингибирования связывания конъюгата "инсулин свиньи-пероксидаза" на 50 требуются в 10 раз более высокие концентрации инсулина быка, чем немеченого инсулина свиньи и человека. Таким образом, полученные моноклональные антитела могут быть использованы для количественного определения инсулина человека, Пример 2, Моноклональные антитела

6Е.6G.2А могут быть использованы для обнаружения инсулина методом блоттинг-гибридизации. На нитроцеллюлозную мембрану наносят 10 — 10 М инсулина, растворенного в 0,15 М ФБР, инкубируют 1 ч при 37 С, а затем 1 ч в 20%. СПК. После этого отмывают в растворе ФБРТ, и нитроцеллюлозную мембрану помещают в раствор, содержащий моноклональные антитела к инсулину, растворенные в концентрации 0,01 мг/мл в ФБРТ, Инкубируют

1 ч при 37 С 1 ч, затем отмывают ФБРТ.

Затем нитроцеллюлозную мембрану помещают в ФБРТ, содержащий конъюгат кроличьих Ig к антителам мыши, меченных пероксидазой (в концентрации 2 мкг/мл по пероксидазе), После отмывания ФБРТ доба вл я ют субстрат диа мин обе н зиди н (2 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 0,2% CoCI2 2,6 MM Hz02. О результатах реакции судят по появлению окрашенного нерастворимого продукта реакции в местах локализации иммуноферментных комплексов.