Способ определения апопротеина а-1 в сыворотке крови

 

Применение: в клинической диагностике и экспериментальных исследованиях биологических сред (моча, спинномозговая жидкость). Сущность: пробу сыворотки крови подвергают химической обработке диметилсульфоксидом, в результате чего выявляются скрытые антигенные детерминанты апопротеина А-1 и апо-В, а затем в одних и тех же разведениях с помощью твердофазного иммуноферментного анализа определяется содержание апопротеинов А-1 и В.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 4

Од

6д

О (21) 4839162/14 (22) 14.05.90 (46) 30,05.92. Бюл. N 20 (71) Институт биохимии СО АМН СССР (72) Л,M.Ïoëÿêoâ, О.Н.Потеряева, Л.Е.Панин и С.Н.Загребельный (53) 615,475(088,8) (56) G.of Lipid Res.,1983, 24, 1683-1645. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПРОТЕИНА А-1 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимическим способам определения апопротеинов в сыворотке крови, Предложенный способ может найти применение в клинической диагностике и экспериментальных исследованиях биологических сред.

Известен способ определения апо-А-1, при котором сыворотку крови обрабатывают тетраметилмочевиной при соотношении проба — реагент 1:1 с последующей постановкой твердофазного иммуноферментного анализа.

Однако добавление к сыворотке крови тетраметилмочевины приводит к необратимой денатурации апо-В, что не позволяет данные образцы одновременно использовать для определени апо-В. Это, в свою очередь, усложняет препаративную технику и требует дополнительного расхода времени и реактивов.

Целью изобретения является одновременное с апопротеином А-1 определение апо-В в той же пробе, а также повышение экономичности способа.

Пример. Одну часть сыворотки крови смешивают с одной частью диметилсуль Ж „„1 73734О А1 (57) Применение; в клинической диагностике и экспериментальных исследованиях биологических сред (моча, спинномозговая жидкость), Сущность: пробу сыворотки крови подвергают химической обработке диметилсульфоксидом, в результате чего выявляются скрытые антигенные детерминанты апопротеина А-1 и апо-В, а затем в одних и тех же разведениях с помощью твердофазного иммуноферментного анализа определяется содержание апопротеинов

А-1 и В. фоксида, Раствор выдерживают в течение 1 а ч при комнатной температуре. После этого готовят рабочие разведения (1:2000—

1;5000) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCI. Обработанные таким способом пробы вносят в ячейки полистироловых планшетов по 100 мкл, В качестве стандартов наносят по 100 мкл растворов апо-А-1 и апо-В, содержащих

1,2,5,10, 20,50,100 мг белка в 0,01 М фосфатно.-солевом буфере(ФСБ). После инкубации планшеты трижды отмывают в ФСБ, содержащем 0,05% Tween — 20 (ФСБТ). Незанятые места сорбции блокируют 10%-ной бычьей сывороткой. В подготовленные таким образом планшеты добавляют по 100 мкл специфических антител в разведении 1

: 3000 в 0,01 М ФСБТ. Связавшиеся с апопротеинами первые антитела на следующем этапе насыщают вторыми антителами. Для этого используют козьи антитела против IgG кролика, меченые пероксидозой (Sigma, USA), которые добавляют в количестве 100 мкл в каждую ячейку (разведение 1: 1000 в

ФСБТ). Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37 С. После 5-кратного отмывания

ФСБТ проводят ферментативную реакцию.

1737340

30

40

50

Составитель В.Брусиловская

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л.Бескид

Редактор М.Циткина

Заказ 1887 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

В ячейки вносят по 200 мкл свежеприготовленного субстрата о-фенилендиамина (Merk, ФРГ) в концентрации 20 мг/100 мл в

0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 0,5, содержащем 0,006 НгО, Через 15 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10 N HzSO4 и измеряют экстинцию при длине волны 492 нм на многоканальном фотометре "Multiscan" (Англия). В качестве отрицательного контроля принимают значение оптической плотности в ячейках, в которые вместо антигена добавляют по 100 мкл ФСБ.

При обработке сыворотки крови человека ДМСО выявление апо-В не отличалось от контрольного.

Проведенное данным методом определение содержания апо-А-1 в крови равнялось 1,05 0,01 г/л, Содержание апо-В составило 0,83 0,01 г/л. КоэффициентапоВ/àïo-А-1 равнялся 0,8. Полученные данные соответствуют литературным. В качестве стандартов использовалась сыворотка с известным содержанием апо-А-1 и В (Colbiochem, США).

Предлагаемый способ, расширяя арсенал способов определения апопротеинов, 5 позволяет определить апо-А-1 и апо-В в одних и тех же пробах сыворотки крови и их разведениях, что упрощает препаративную технику этих апопротеинов. При этом способ характеризуется высокой эффективно10 стью, дешевизной используемого реактива, меньшей его токсичностью для персонала, проводящего определения.

Формула изобретения

15 Способ определения апопротеина А-1 в сыворотке крови, включающий обработку пробы реагентом при соотношении его к пробе 1: 1 и последующий твердофазный иммуноферментный анализ, о т л и ч а ю щ и20 и с я тем, что, с целью одновременного определения а по-В в той же пробе при повышении экономичности анализа, в качестве реагента используют диметилсул ьфоксид,