Способ определения адгезивности тромбоцитов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения адгезивности тромбоцитов путем подсчета относительного количества их в плазме до и после пропускания еэ через коллагеновый пористый материал, содержащий в своем составе 0,5-0,25% аденозиндифосфорный кислоты. Различия в индексе адгезивности здоровых и больи ых людей позволяет определить их функциональную неполноценность , а также длет объективную величину активности различных антиагрегантов и лекарственных средств. Способ позволяет определять адгезивность тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме в условиях клиники, не прибегая к их выделению и концентрированию . Способ позволяет дифференцировать активные и неактивные тромбоциты при vx. дефиците в случае тромбоцитопении.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33 /53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 4 (л)

О, ), О

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4772000/14 (22) 27.11,89 (46) 15.05.92.Бюл,N 18 (71) 1-ый Московский медицинский институт им.И.M.Ñå÷åíoâý (72) А.Я.Смоляницкий, Л.П.Истранов, Г.А,Якунин, P.Ê.Aáoÿíö, Е,В,Истранова и

С.Н.Осипов (53) 612.015(088,8) (56) Лабораторные методы исследования в клинике; Справочник под ред.проф.В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с.152. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения

Изобретение относится к медицине, в частности к способам оценки функциональной активности тромбоцитов, и может применяться для диагностики функциональной патологии тромбоцитов, а также для контроля за действием лекарств, влияющих на функциональную активность тромбоцито», Известен способ определения адгезивности тромбоцитов в условиях клиники, заключающийся в подсчете количества тромбоцитов в цитратной крови до и после пропускания ее через попихлорвиниловую трубку, заполненную мелкими стеклянными шариками. Расчет индекса адгезивности тромбоцитов представляет собой выраженное в процентах отношение количества тромбоцитов, задержавшихся на стеклянных шариках к исходному количеству тромбоцитов в крови.

„„Я2„„1734020 А1 адгезивности тромбоцитов путем подсчета относительного количества их в плазме до и после пропускания ее через коллагеновый пористый материал. содержащий в своем составе 0,5-0,25% аденозиндифосфорный кислоты. Различия в индексе адгезивности здоровых и боль ых людей позволяет определить их функциональную неполноценность, а также дает объективную величину активности различных антиагрегантов и лекарственных средств. Способ позволяет определять адгезивность тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме в условиях клиники, не прибегая к их выделению и концентрированию. Способ позволяет дифференцировать активные и неактивные тромбоциты при vx дефиците в случае тромбоцитопении.

Для осуществления этого теста нужно 2 мл цитарной крови и инфузионный насос, обеспечивающий непрерывное равномерное продвижение исследуемой крови по колонке со стеклянными шариками.

Недостатком споссбя является также и то, что при пропусклнии интактной тромбоцитарной плазмы через колонку со стеклянными шариками прнлипания тромбоцитов не происходит.

Целью изобретения является повышение чувствительности, упрощение и ускорение способа, з также возможность определения адгеэивности тромбоцитов в плазме, Следует отметить, что обеспечение возможности исследования тромбоцитарной плазмы является значительным достижением, поскольку np«этом возможна стандартизация количества тромбоцитов в

1734020

15

55 исследуемом образец, что повышает достоверность определения путем разделения тромбоцитарной плазмы человека его же быстротромбоцитарной плазмой до стандартного количества, например, 100000 или

200000 тромбоцитов в 1 мкл и устраняется возможное влияние других клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов), на адгезивность тромбоцитов, Укаэанная цель достигается тем, что в качестве материала, с которым взаимодействуют тромбоциты, сохраняющие хотя бы минимальную способность к адгезии, используют коллагеновый материал, содержащий АДФ (аденозиндифосфорная кислота), при соотношении коллаген-АДФ (мас.%), (99,5-99,75) — (0,5-0,25).

Способ осуществляют следующим образом.

Из коллагенового материала вырезают цилиндрический кусочек толщиной 5-7 мм и диаметром 5-7 мм, который вставляют в пластиковый наконечник стандартной автоматической лабораторной пипетки на 200-500 мл и опускают его в пластиковую пробирку соответствующих размеров (для сбора профильтрованной плазмы). После этого из исследуемой тромбоцитарной плазмы берут пробу для подсчета исходного количества тромбоцитов, а затем 200-400 мкл тромбоцитарной плазмы вносят в наконечник с коллагеновым материалом, после чего наконечник присоединяют к пипетке и нажатием колпачка пропускают плазму через коллагеновую губку. Пропущенную плазму встряхивают и отбирают от нее пробу для подсчета количества тромбоцитов. По результатам подсчета тромбоцитов в плазме до и после прохождения ее через коллагеновый материал, рассчитывают как обычно индекс адгезивности тромбоцитов, Для целей диагностики и контроля за действием ингибиторов адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов используют коллагеновый материал, который в норме задерживает не менее 30% тромбоцитов, содержащихся в плазме. Такие свойства присущи коллагеновому материалу, приготовленному из раствора коллагена в сочетании с АДФ при соотношении коллаген-АДФ, равном (мас.%); (99,5-99,75)(0,5-0,25).

Пример 1. Диагностика врожденного нарушения функциональной активности тромбоцитов (тромбоцитопатии). Описанным способом со стандартной тромбицитарной плазмой (200000 тромбоцитов в 1 мкл) on ределяют адгезивность тромбоцитов у 10 здоровых людей и больного с врожденным нарушением секреторной реакции тромбоцитов, установленным на основании тщательных исследований системы гемостаза, включающих определение адгезивности тромбоцитов обычным способом, а также агрегацию тромбоцитов при стимуляции АДФ, коллагеном, адреналином и ристомицином. У здоровых людей индекс адгезивности колебался в пределах 35-65% и составил в среднем 5014%, индекс адгеэивности у больного составил 8%. Получаемое различие в индекс адгезивности тромбоцитов позволяет диагностировать их функциональную неполноценность (тромбоцитопатия).

Пример 2. Оценка активности ингибитора функции тромбоцитов. Определяют адгезивность тромбоцитов в нормальной плазме, содержащей водорастворимый аспирин в концентрации 1 ммоль/л и в нормальной плазме, к которой был добавлен вместо аспирина адекватный объем физио логического раствора NaCI, При исследовании плазмы, содержащей антиагрегат, индекс адгезивности тромбоцитов равнялся

2, в контроле 47% Различие в индексе адгезивности тромбоцитов дает объективную величину активности ингибитора.

Предлагаемы.п способ пригоден для определения адге: ивности тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме, Известно, что оценка адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов при тромбоцитопении обычными методами невозможна. При необходимости исследователи прибегают к выделению тромбоцитов из большого обьема плазмы посредством центрифугирования или гельфильтрации и последующему их концентрированию посредством ресуспендирования в очень небольшом объеме специально приготовленного буферного раствора.

Поскольку э1и методы являтюся очень трудоемкими и дорогостоящими, они практически не применяются в клинических условиях и доступны лишь некоторым исследователям.

Предлагаемый способ дает возможность определять адгезивность тромбоцитов в условиях клиники, не прибегая к их выделению и концентрированию. Это достигается тем, что подсчет тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме до и после пропускания через коллагеновую губку с повышенной тромбоцитзадерживающей способностью ведется не в обычном объеме плазмы, а в несколько большем объеме плазмы, Например, если обычно плазму для посчета тромбоцитов в тромбоцитарном счетчике разводя г в 3000 раз (3,3 мкл плазмы разводят в 10000 мкл изотона).то при

1734020

40

50

Составитель А.П,Агуреев

Редактор Ю. Середа Техред М.Моргентал Корректор М.Демчик

Заказ 1667 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 тромбоцитопении разводят в 500-670 раз 1520 мкл плазмы разводят в 10000 мкл изотона, Пример 3, Определение адгезивности плазмы при тромбоцитопении, При подсче- 5 те количества тромбоцитов в крови и плазме больного оказалось, что их было меньше

30000 в 1 мкл. Поэтому определить адгезивность тромбоцитов известным методом при столь небольшом количестве их практиче- 10 ски невозможно, поскольку количество задерживающихся тромбоцитов находится в пределах ошибки метода, Производят подсчет тромбоцитов в плазме, взяв не 3,3 мкл плазмы, как это 15 делается обычно, а 20 мкл. При этом количество тромбоцитов в плазме оказалось равным 194000 в 1 мкл.

Пропускают 200 мкл тромбоцитопенической плазмы больного через коллагено- 20 вую губку и снова подсчитывают количество тромбоцитов в 200 мкл. Аналогичным образом определяют индекс адгезивности тромбоцитов в 10 пробах нормальной плазмы. предварительно подсчитав количество тром-?5 боцитов в тромбоцитарной плазме и затем разведя ее быстромбоцитарной плазмой до содержания менее 30000 тромбоцитов в 1 мкл, т.е, определяют индекс адгезивности тромбоцитов в 10 пробах нормальной плаз- 30 мы с очень низким содержанием тромбоцитов.

Сравнивают индекс адгезивности в норме (при искусственной тромбоцитопении в нормальной плазме), который колебался в пределах 11-30 и равнялся в среднем 20 3, и больного тромбоцитопенией, у которого индекс адгезивности составил 0 . Эти результаты позволяют диагностировать у больного тромбоцитопеническую тромбоцитопатию, т.е. наличие у больного не только дефицита, но и дефекта тромбоцитов.

Таким образом, предлагаемый способ заметно повышает чувствительность метода, достаточного для дифференциации активных и неактивных тромбоцитов при их дефиците.

Формула изобретения

Способ определения адгезивности тромбоцитов путем фильтрации крови с последующим подсчетом количества тромбоцитов крови, задерживающихся на фильтре, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, упрощения и ускорения способа, а также возможности определения адгезивности тромбоцитов в плазме, подсчитывают количество тромбоцитов в цитратной крови или плазме до и после фильтрации через материал, содержащий коллаген дермы и аденозиндифос фат при их соотношении (мас, ); (99,5-99,75) — (0,5-0,25), и рассчитывают в процентах количество тромбоцитов, задерживающихся в материале.