Штамм бактерий bacillus suвтilis для получения препарата против возбудителя серой гнили земляники

 

Использование: микробиологическая промышленность, сельское хозяйство, получение средств защиты ягодных культур от возбудителя серой гнили - Botrytis cinerea. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 культивируют на сусло-агаре при 37°С в течение 7 сут до получения спор, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию разводят до получения титра 60 и 100 млрд. спор в 1 мм (по оптическому стандарту мутности ), вносят наполнитель - сахарно-желатиновую среду и лиофилизируют. Антагонистическая активность полученного препарата по отношению к Botrytis cinerea, определяемая по зоне лизиса, составляет 19-21 мм. Опрыскивание растений земляники препаратом на основе штамма Bacillus subtilis снижает повреждаемость ягод серой гнилью на 8,6-10,6% по сравнению с контролем и позволяет получить прибавку урожая на 1,6-2,2 ц/га. 6 табл. (Л

() 9) ((I ) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4739795/13 (22) 25.09.89 (46) 07.06.92. Бюл. N 21 . (71) Украинский научно-исследовательский институт садоводства (72) А.М.Лапа, С,P.Ðåçíèê и С.В.Лапа (53) 576.8(088,8) (56) Ванек Г.; Корчагин В.Н, и др. Атлас болезней и вредителей плодовых, ягодных, овощных культур и винограда, 1975, с, 364.

Авторское свидетельство СССР

ЬЬ 1347445, кл. А 01 N 63/00. 1988.

Патент СССР

hL 1477231, кл. А 01 и 63/00, опублик.

30.04.89. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

SUBTILIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕРОЙ ГНИЛИ

ЗЕМЛЯНИКИ (57) Использование: микробиологическая промышленность, сельское хозяйство, пол4

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к разработке средств защиты ягодных культур, преимущественно земляники, от возбудителя серой гнили Botrytis cinerea.

Известна защита земляники химическими препаратами путем опрыскивания растений в период вегетации, до цветения, -Однако применение их не предотвращает поражение серой гнилью. так как в период роста и созревания ягод применение фунгицидов запрещено. В годы с дождливым и прохладным летом серая гниль почти полностью уничтожает урожай земляники. учение средств защиты ягодных культур от возбудителя серой гнили — Botrytis cinerea.

Сущность изобретения: штамм бактерий

Bacillus subtilis ЦМПМ В вЂ” 2895 культивируют на сусло-агаре при 37 С в течение 7 сут до получения. спор, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию разводят до получения титра 60 и 100 млрд. спор в 1 мм (по оптическому стандарту мутности), вносят наполнитель — сахарно-желатиновую среду и лиофилизируют.

Антагонистическая активность полученного препарата по отношению к Botrytis cinerea, определяемая по зоне лизиса, составляет

19-21 мм. Опрыскивание растений земляники препаратом на основе штамма Bacillus

subtllls снижает повреждаемость ягод серой гнилью на 8,6 — 10,6% по сравнению с контролем и позволяет получить прибавку урожая на 1,6 — 2,2 ц/га. 6 табл. 4

Известны штаммы рода Bacillus — про- (>Д дуценты веществ, использующиеся для био- рр логической защиты растений. Так, штамм

Bacillus puneiIus 0097/1 используется для борьбы с возбудителем парши яблони; штамм Bacillus subtllis APPL-1 используется для борьбы с ржавчиной бобовых. Однако эти штаммы не являются антагонистами возбудителясеройгнили-Botrytiscinereaи а не могут применяться на землянике.

Наиболее близким к изобретению является способ борьбы с заболеванием земляники, возбудителем которой является гриб вида Botrytls clnerea, предусматривающий обработку растений земляники в фазе роста и бутонизации (14-22 июня) антагонистом

1738200 вышеуказанного вида гриба, в качестве которого используют один из штаммов

Streptomyces grlscovirldes АТСС .3927139273, Однако применение микроорганизмов р.Streptomyces в качестве агентов биологической борьбы с серой гнилью земляники сопряжено с рядом технологических трудностей, а именно: а) для наращивания биомассы применяются дорогостоящие питательные среды, в т.ч. являющиеся пищевым сырьем (солодовый экстракт, казеионовый гидролизат, глюкоза или лактоза); б)трехкратная обработка; в)кроме того, известно, что представители указанной группы микроорганизмов— стрептомицеты, могут в отдельных случаях служить причиной заболеваний теплокровных.

Цель изобретения — получение более технологичного штамма бактерий ВасИЬз

subtllis для получения препарата против возбудителя серой гнили земляники—

Botrytts с1пегеа.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Штамм выделен иэ почвы Киевской области. в 1982 году, идентифицирован по

"Краткому определителю бактерий Берджи".

Штамм депонирован в коллекции культур Центрального Музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" под номером: ЦМПМ В-2895, в качестве штамма, обладающего высокой антагонистической активностью.

Морфолого-культуральные признаки

Bacillus subtllls ЦМПМ В вЂ” 2895 — культура спороносная, аэробная, граммположительная. В мазках из колоний, выросших на МПА через 18 ч, обнаруживаются прямые палочковидные клетки 1,9-2,1х0,3-0,4 мкм, расположенные одиночно, изредка цепочкой.

Клетка при спорообразовании не раздувается, после раста на глюкозном агаре в протоплазме глобулы не обнаруживаются, На

МПБ культура образует пленку, Через 48 ч роста при+37 на среде Громыко и сусло-агаре культура имеет вид шероховатых плоских тусклых колоний с фестончатым краем, диаметром 5-8 мм, светло-серого или телесного цвета, пастообразной консистенции, хорошо снимается петлей с поверхности arapa.

Через48ч роста при+37 настрептомицетном и картофельном агаре культура имеет вид гладких, плоских колоний со слегка, волнистым краем, диаметром 3-4 мм, телесного цвета, пастообразной консистенции, хорошо снимается петлей с поверхностью

arapa.

Минимальная температура роста

Bacillus subtllls ЦМПМ В-2895 колеблется в

5 пределах 5-20 ;.максимальная от +450 до

+55; оптимальная +28й37 .

PH среды минимальные 4, максимальные 8, оптимальные 6-7.

В качестве органических источников

10 азота штамм Bacillus subtills ЦМПМ И-2895 может использовать следующие органические соединения: пептон, гидролизат каэеина, дрожжевой автолизат; неорганические соединения: аммонийные соли (NHzNOs;

15 (NH4)4S04), нитраты (КМОз, йайОз), Штамм хранится на МПА. среде Громыко (МПА+СА), агаризованной среде Гаузе М

2 под слоем стерильного вазелинового масла, пересев — 1 раз в год.

20 Маркерный признак штамма: штамм, устойчив к антибиотику — полимиксину. Характерной особенностью штамма, является. его избирательное воздействие на возбудителя серой гнили — Botrytis cinerea, 25 . Физиолого-биохимические свойства, . Ферментирует глюкозу, арабинозу. маннит, ксилозу с образованием кислоты без газа. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, жела30 тину, растет при 7% NaCI, утилизирует цитрат, пропионат не использует. Культура не растет в анаэробных условиях и при 10%

NaCI, не образует газ из ИОз в анаэробных условиях, не обладает аргининдигидрола35 зой, лецитиназой. В протоплазме клетки не обнаруживаются включения полиф-оксимасляной кислоты.

Штамм не патогенен для теплокровных животных.

40 Данные о непатогенности штамма

Bacillus subtills ЦМПМ В вЂ”.2895. Суспензии . штамма Bacillus subtllis ЦМПМ В-2895, выращенного в течение 24 ч на мясо-пептонном агаре (МПА) при+30 С, 45 Фильтрата культуральной жидкости штамма Bacillus subtills ЦМПМ В-2895; выращенного в течение 15 сут на жидкой среде

Гаузе N. 2 при+30 С.

Проверку патогенности осуществляли

50 на белых мышах весом 18-20 r. Животным вводили суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в иньекциях.

Результаты исследования токсичности фильтрата культуры Вас!!Ьз subtllls ЦМПМ

55 В 2895 после роста на среде Гаузе N. 2 представлены в табл.1.

Результаты исследования вирулентно- . сти Суспензии культуры Bacillus subtllts

1738200

ЦМПМ В вЂ” 2895, выращенной в течение 24 ч при+37 С на МПА представлены в табл.2.

Наблюдения за животными проводили ежедневно на протяжении 15 дней после окончания инъекции или перорального введения. В период наблюдения все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отравления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Все подопытные мыши после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты и их органы подвергнуты макроскопическому изучению.

Результаты вскрытия показали:

Сердце — обычной формы и величины, Легкие — в объеме. не увеличены, доли легко отделяются друг от друга, поверхности гладкие, спаек не отмечается.

Желудок, петли тонкого и толстого кишечника — внешне представляются обычны. ми, при вскрытии просвета рисунок слизистой не изменен. Печень — темнокрасного цвета, среднего кровонаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие.

Почки.— обычных размеров и формы.

Поверхности гладкие, на разрезе четкий рисунок коркового и мозгового вещества.

Селезенка — не увеличена, плотной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темнокрасного цвета, Таким образом, введение суспензии 24часовой культуры Bacillus subtllis ЦМПМ В2895 перорально в дозах 1 — 5 млрд микробных клеток и внутрибрюшинно в дозах 1-10 микробных клеток на одну мышь не вызывало у мышей каких-либо признаков . заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявило у них патологических изменений, регистрируемых макроскопиче. ски.

Введение мышам фильтратов среды роста (после культивирования штамма

Baciilus subtilis ЦМПМ В вЂ” 2895) на жидкой среде Гаузе N -2 не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Приведеные данные дают основание

-. считать, что штамм Bacillus subtilus ЦМПМ

В-2895 не вирулентен и не токсиченен, т.е. не патогенен для теплокровных животных, Штамм обладает высокий антагонистической активностью в отношении возбудителя серой гнили земляники — Botrutis cinerea, а также к фитопатогенным бактериям и грибам, патогенным и условно патогенным микроорганизмам (табл), Антагонистическая активность штамма

Bacillus subtills ЦМПМ В вЂ” 2895 представлена в табл.3.

Получение препарата против возбуди5 теля серой гнили земляники Botrytis cinerea на основе штамма бактерий ВасИ Оз subtllls

ЦМПМ В вЂ” 2895. Основные этапы изготовления препарата; подготовка штамма — засев на косячки с сусло-агаром, инкубирование

10 при+37 втечение 18-24ч.

Пересев на бактериологические матрицы с твердой средой — сусло-агар, стоимость

1 л которого составляет 14 коп, в то время как для выращивания штаммов

15 Streptomyces grlseovirides АТСС 39271—

39273 используются дорогостоящие питательные среды.

Инкубирование при+37 в течение 7 сут для получения спор. Срок культивирования

20 Streptomyces griseovirides! АТСС 3927139273 составляет 12 дней (5 дней со встря- .. хиванием и 7 дней беэ встряхивания), Контроль спорообразования штамма

Bacillus subtilis ЦМПМ В -2895 проводим .25 микроскопически. С агаризованной среды культуру смываем физиологическим раствором. Полученную суспензию клеток доводим до 60 и 100 млрд спор в 1 мл (по оптическому стандарту мутности).

30 Биологическую активность полученной суспенэии спор (которую квалифицируем как препарат) определяют по антагонист:ческой активности бактериальной культуры в отношении Botrytis cinerea — возбудителя

35 серой гнили земляники методом радиальных штрихов.18-часовая культура высевается в центр чашки Петри с сусло-агаром на площадь, очерченную кругом диаметром 2,5 см. Через 3 сут инкубирования при +28O

40 подсевают по радиальным штрихам тесткультуру Botrytis cinerca из бактериальной суспензии 5 10 кл/мл. Зоны отсутствия

8 роста учитывают через 18-24 ч инкубирования..

45 Проверка опытных серий культуры

Bacillus subtilis ЦМПМ В вЂ” 2895, выращенной при 37 на среде сусло-агар, содержащей 100 млрд КОЕ в 1 мл представлена в табл.4

Наличие зон отсутствия роста Botrytls

50 cinerea — 19 — 21 мм свидетельствует о высокой антагонистической активности штамма

Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895, Для длительного хранейия препарата в полученную суспензию клеток вносят на55 полнитель — сахарово-желатиновую среду (4 и 1 Д соответственно) к общему объему и разливают в лотки из нержавеющей стали.

Помещают в морозильную камеру при температуре не выше -20 на 48 ч. Затем проводят лиофилиэацию в вакуумных сушильных

1738200

Таблица. 1

Таблица 2 камерах в течение 36 ч при температуре от

-20 до+36 . Контроль бактериальной чистоты препарата проводят методом рассева на агаризованные питательные среды (МПА, Гаузе М 2, Громыко, картофельный агар, стрептомицетный агар), Антагонистическую активность полученного препарата на основе штамма

Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 по отношению к тесткультуре Воъгут!з clnerea определяют методом радиальных штрихов.

Антагонистическая активность опытных .серий препарата на основе штамма ВэсИ!из

subtilis ЦМПМ В-2&95(после лиофильной сушки) представлена в табл.5.

Пример. Препарат против возбудителя серой гнили земляники получают наращиванием штамма -ВасИЬз subtHis ЦМПМ

В-2895 на твердой среде сусло-агар при . +37 втечение 7 — 10сутдля получения спор.

Культуру смывают физиологическим раствором. Готовят рабочую суспензию с титром

60 и 100 млрд спор в 1 мл из,расчета 1 л/га.

Расход рабочей жидкости 600-800 л/га.

В полевых условиях действие препарата проверяют на устойчивом к возбудителю серой гнили Botrytls cinerea сорте земляники — Ясна. Опыты проводят на сорте ЗенгаЗенгана, являющимся восприимчивым к возбудителю Botrytls cinerea, что не дает воэможности делать вывод о его более высокой эффективности.

Насаждения земляники были инфицированы конидиями Botrytis clnerea. Фоновая нагрузка составляет 2-10 конидий в 1

6 мл. Через одни сутки делянки однократно опрыскивались препаратом на основе штамма Bacillus зиЫИз ЦМПЫ В-2895 с . титром 60 и 100 млрд спор в 1 мл в фазу роста и начало созревания плодов, поскольку возбудитель находится на растительных остатках, черешках, чашелистиках. До фазы цветения и после сбора урожая рекоменду5 ется применять химические средства защиты (против серой гнили — байлетон 25 с.п; с нормой расхода 0,24 кг/га, который испытан нами как эталон). В фазы после цветения, роста и созревания плодов применять

10 химические средства защиты категорически запрещено. В благоприятные для развития болезни годы (дождливая, туманная. погода) погибает практически весь урожай. Применение в этот период препарата на основе.

15 Bacillus subtllis ЦМПМ В вЂ” 2895 позволит значительно сохранить урожай.

Эффективность Bacillus зцЬМИз против серой гнили земляники в сравнении с фунгицидом ОПХ УНИИС "Новоселки"(фаза ро20 ста и созревания плодов) представлена в табл.6.

Опрыскивание растений препаратом. на основе штамма Bacillus subtiiis ЦМПМ В2895 снижает поврежденность ягод серой

25 гнилью на 8,6-10;6 по сравнению с контролем, и на 6;З по сравнению с эталоном, развитие болезни — на 46,24-57 . Предлагаемый способ борьбы с серой гнилью зем. ляники позволяет получить прибавку

30 урожая 1,6-2,2 ц/га (при средней урожайности плантации 50 ц/га), что составляет 228— . 294 руб/га.

Ф ор мул а изобретен и я

Штамм бактерий Bacillus зиЬОИз ЦМПМ

В-2895 для получения препарата против . возбудителя серой гнили земляники.

1738200

Продолжение табл. 2

Та блиц а 3

Зоны лизиса тест-куль- туры, мм

20-21

12-16

13-15

15-17

14-16

15-17

claviforme

10-13

i 5-17

15-1.8

32-33

40-31 .

stenley

25-27

40-42

retlgeri

tropicales

5-7

12-14

20-22

25-27

Тест-культуры

Botrytis cinerea

Monilia fructigena

Phizopus nigri cans

Xantomonas malvaceaгиг

Penici1 1.ium expansum

Ги аг1.иг. oxysporum

Verticillium dalie

Ihi1 aviopsis basicola

Salmonella stenley 5266

Proteus vulgaris Ff

vulgaris 72

Staphylococcus aureus 209

Candida albicans

Ervinia euratovora

Aspergillus niger

Ецшх8асiип I

fumigatum °

flavum 282

fumigatum 507

30-32

20-23

40-31

10-13.

40-43

1.5-1 7

Табл ица 4

1738200

Таблица 5

Таблицаб

Варианты опыта Рабочая кон- Поражен- Развитие Урожай, центрация ность болезни,Ф ц/га ягод,4

18,6

100

Контроль вода

66,12

0,043

48,9

12,3

"9,6

53,76

8,0

43,0

100 млрд спор/мл

50,2

Составитель Т.Полянская

Редактор B.Бугренкева Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Король

Заказ 1945 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород„ул,Гагарина, 101

Байлетон,254 с.п. норма расхода

0,24 кг/га (эталон) Штамм Bacillus

subtilis ЦИПИ

В-2895

60 млрд спор/мл