Способ получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ

 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ против возбудителей болезней растений . Целью изобретения является упрощение способа получения ферментного препарата и улучшение его качества. Получение ферментного препарата включает следующие этапы: выращивание исходных растений картофеля, индукцию ферментной активности путем инокуляции X-Y-вирусов картофаля, или дсРНК, приготовление экстракта листьев и сорбцию содержащегося в нем фермента на аффинном сорбенте . Полученный ферментный препарат представляет собой фермент (олигоаденилатсинтетазу). иммобилизованный на дсРНК-целлюлоэе, и характеризуется способностью синтезировать из АТФ вещества (олигоаденилаты), обладающие антивирусной активностью на листьях растений, которые можно обнаружить выделением на ДЭАЭ- или ПЭИ-целлюлозе. Полученный препарат характеризуется также способом выделения на афинном сорбенте - средством олигоаденилатсинтетазы и двуспиральной РНК (дсРНК). 3 ил., 4 табл. VI О О го

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4624147/13 (22) 21.10.88 (46) 30.12.91. Бюл. N 48 (71) Научно-исследовательский институт картофельного хозяйства Научно-производственного объединения по картофелеводству (72) А.В.Бабоша, М.Е.Ладыгина и Л.Н.Трофимец (53) 577.15.07(088,8) (56) Denash Y., Sela 1,, Suhadolnik R.i.

Enzymatic synthesis of plant oligoadenIlates

ln vitro" "Meth. еп угпоГ, 1986, ч,119, р.752—

758.

Reichman М. ес al. Human leukocyte

interfегоn and the antiviral factor (AVF) from

virus-infected plants stimulate plant tissues

to produce nucleotides with antiviral activity, "Иго!.", 1983, ч 128, N 1, р.240-244. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СИНТЕЗА АНТИВИРУСНЫХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу получения ферментИзобретение относится к вирусологии, в частности к способу получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ против возбудителей болезней растений.

Известен способ получения фермента олигоаденилатсинтетазы растительного происхождения из листьев растений табака, инокулированного вирусом табачной мозаики (ВТМ) или интерфероном, который состоит в том, что листья табака сорта, „„ЯЦ„„1701227 А1 (я)э А 01 N 63/00, С 12 N 9/04, 7/04 ного препарата для синтеза антивирусных веществ против возбудителей болезней растений. Целью изобретения является упрощение способа получения ферментного препарата и улучшение его качества. Получение ферментного препарата включает следующие этапы: выращивание исходных растений картофеля, индукцию ферментной активности путем инокуляции Х-Y-вирусов картофеля, или дсРНК, приготовление экстракта листьев и сорбцию содержащегося в нем фермента на аффинном сорбенте, Полученный ферментный препарат представляет собой фермент (олигоаденилатсинтетазу), иммобилизова нный на дсРНК-целлюлозе, и характеризуется способностью синтезировать из АТФ вещества (олигоаденилаты), обладающие антивирусной активностью на листьях растений, которые можно обнаружить выделением на

ДЭАЭ- или ПЭИ-целлюлозе. Полученный препарат характеризуется также способом выделения на афинном сорбенте — средством олигоаденилатсинтетазы и двуспиральной P H V. (дсРН К). 3 ил., 4 табл, обладающего сверхчувствительностью к

ВТМ, инфицируют этим вирусом, Затем лисТоауе ткань гомогенизируют в 0,01 М фосФатном буфере рН 7.6; экстракт обрабатывают гидратированным фосфатом кальция и наносят на колонку ДЗАЗ-целлюлозы.

Несорбируемую фракцию и ропускают через колонку с дс РНК-агарозой,К связавшемуся с носителем ферменту добавляют 0,005 М

АТФ и инкубируют5ч при 25 С, Продуктом реакции являются антивирусные вещества олигоаденилатной природы.

1 /0 1 2:;((г г

F (ГГ(СГгО/1 ЬЗОВа НИЕ р,-lо-f BH(JII 1;. i 13 ".B В;, -(f 16" стве источника ., ермснтного препарата ииеет ряд Hàîooòa. K(i!i... у(я до.-(т,,ск,.-ни.", 1461«бХОДИМОЙ Qтадгг(гг ОВЗВИ(гИЯ 1 iBOT(,Н г((гг . ребуется дг;во/(ьно lof;b Го:;- в", ъ. вь((:а-!

Дивани>1 — 2-. I меся IB, j 6) I-Ijafjj)f :. Рь(ра

Ш ИВВН1АЯ РагтеНИ..—; .f с .33КВ 31; Л )Чае г

Д 13 П Of Н И ТЕ) I 1: Н г:16 т ! Д С B Ы Е 3 1 1 ". - : ., Н:- : Г С Л

УЧЕНИЕ И - ::..":ДК/ Ра,с-са,((г.-.,!.,ЛЯ ()г.. :,u .FÈ акт !BHocTI (оли(оаден fl син-".)тз.b! Г р(4—

МBНЯВТС =, Bi . СОКОЬИруленТ(1 ЫЙ Г:!г рус баЧНОЙ МОЗВИ (И: и M(, -!"О г)гр II(jij(IBBBT широкое yii: льзов - :-(и-= - т joi ".. .OBÜB.

l3g;g г: В(1ВС-(с i )у з,(.(С Ис г,г г1(:(.

ПВТОГЕНОВ Pq YЗ -,- ПЛ(,;Чьгь; Г ",=„ЛГ," YO,:O (ЯЙ".:;—

BI8HHbIÕ КУЛЬТУГ;", В -13СТНГ г . Iaг.(а j(i!!, .С((ЕД-.

СтВИЕ ЗЫССК. Й КО. :таг(1()"- !HO ., М;"::):г::)а, ;."1т;-:;

3 ИМ ВИР,1 П1„«ТГ18Р1, .- l „,,.ij"!,г гг )г)(Рг" 14НI J(1 (гПЛИЧНЬ(6 ()О Сi.: ДЛ 6 11";:11 i! È )Р, "

ТЕНИЙ HBKO(l((1 !" (-.ЛЕЙ И 1-(г :)ге(1 il(F)Ö И IHCIK<(fj(FIр()ВВННЬ(Х pBO j 611ИИ 3 1 - К)г(6: I(I г ЕЛ iii ii)8

ОбеззаРаскивание оде)КД.(.: 1нс., РУме(4тов, 8 Про(;8ССЕ ИН(!с(11ирова((ИЯ 31,(1 pB(16;-(ИЙ

1 с бск 1, 6(1 ()1(а jiyix !1i, I дч ч г!1: .г. (1 фс р(ггген) а происходит -(екротизс(((ия части ткани и HBкопление не-.оторого Kof IHBOTIBB вируса.

Методика (: H(633 антивир (сн ьгх вешес Гв с

Г(Рименени8i.i BK ".TPB(TB инфиц РВВВННоА

ТКВНИ HB ИС!.ЛГОЧаЕт 1)ОЗМ(31)КНО(стИ Г(ОПадаН11Я В 1сVi В Г л .-1 ъЕМ(! КГ(Н8ЧН и -: )Г Д!

Использов::(ние в ка -, естве инд)к Гора

Д(>ф(г((гитсгОГ(1 - BOOED(г ()г(11((г((11гс 1 с П -iP YFII iB

УВЕЛИ ИВВЕт Се.ia.-.тОИ,)ОС..Ь фЕ(Зг(6:гт.-;, ИЯВЕС18Н СПОСОО ПОЛ((г- .6Н(1Я Р =, 1 ..!(ITI(;1

НОЙ О(!ИгосздеН(гль ГСИНТ8ТВЗЫ И:г К(13 ;ОК Т = бака, культивируег! Цх l

Цель И3ohpáтения -упрощен.";е способа

И ПОЛ (ЧВНИ6 ("ЕрМВНТ(-:ОП) (товгга(.B" а -(8 СОдеря(ащего ajf(рус, На ФИ1.1 Г(О «азаНС Х(BC!(i.(BТО:"()3.1)г1ЧВ((КПВ разделение 13(од!(K! с в с:.;н" еаза;- а,r,:-((!,3

1(()ЛЛЮЛ038: На ФИГ,i — 3(4т(г В:(1О f" ая Зкт(г(в -(() Ст Ь П . )Л I"- 6« I"I b(. » С,". .13. .":.:(1 Е 1 -"4 1(1 Й Н B ((Ijf J:-.Ó:K

ДИКОГ(», (га. т.-!ф „()я P E 11 (, 1 jppг- .! . —. °:, ° гг

МОСТЬ ВКТ(ЛВНСГСТ!г(аН ((id!I Р, Н1,;Х,;.)ЕД((1148НИЙ О l КОНЦен (гаЦИИ liP81lBPBTB Нс(ЛИСТЬЯХ

М(сот(апа gl()t(. oBB, (113Л)(ЧВНИ6 фер(гг(614ТНОг(О Пр(!Паратa (! Лк)чает следу(ощие зтапь(; выраа(иван (е

ИСХОДНЫХ РаСтЕНИЙ КаРтофЕЛЯ, .гн)1,.",/К(1((11 (()ВРМВ IT((OK агс ГИВ НОС(И i(ll I/ I 6(г1 И! 1(гс)(ЛЯ .((1(г1

Х, I/ ВИРУСОВ К3РТОфеЛЯ (1Л(г(ПО(1 ГО" Гг(ггя(6, 4ИС! з кстракта листьев и сс рбци(а содер)1 :=L (.Гя В НЕМ фЕрМВ!Нта На афф((Н((пг(1 Спг)бе" (те

П(ЗЛУЧЕННЫЙ феРМВН ;НЬ!" II .113гП3;,:31 )Р6,((СТВВЛЯет (;! г:38 ((фЕГ) г18Н(Т;",(Л,11 Оага((z!1.3

6(1Hl BÒBB,(j, !ЛММС! ".:И1Л i- . la a ..I I-, (о Н - .

ДС Г: K I! 6/ i1KBn\)36 И Ха(Рс) КтеРИУ6ТСЯ собыос(ьго си:- -. ези,зовать ylç АТсг вещества (((г!1(гоаде(4ь1лат(г(1, ()бла Бак) Ill!6 аьп ивиоус гг ((! ТИВ! Ггг i Ь(С Ь Л11г т 1 Ч ТЕг4с1И 11 КОl i3pb!i iFiO .(,-,-,- Обиаруягггггтв Г-,;Л-, ("НИ81

1 (-,/- г,"4 — .Г . 1 г:;- . U6."гл ГОЛО "Е

И i " 6 ".:G ó(466((-1.;В (ЬЕОМеiH1-(-.ГОГО ! 63ВИРУС!(b!Е l!\BC(fOÍ Y,jl Каог ф;-.;,.Я

I°, г с(а(ИИр ""- В ":3 аеас 3 1 .,IFiy::.Сяцсг (1НОК1(I!!OI(ИНфеК: ИОс!НЬ,,;;,;;.:;"-,, i:(г,:„:.;„!ск 3 1)3((11-3 г

Зi(if i.; (T! !3!Ii! (О (Т(pBJ.(ве((ЕН,. :.:,,гг "., 1; (сот(гИ,if:,,;ро ь =",-:-. -й золой ;о . -o KB..::. : -j:!,:- YB!; o !с(lii. г 1 "гl "* г 3 гг 1 i. IilT".!

I-,,". : : 1 !!l, i 1 0 ((К. : f4, B!jJ(8 г,,3 г ира;-(ия Хо((оков ь:,.K;;iil,-,..сев Jо()дос(Р;-„ПЙ 1-УбкоЙ c iajo; г:.:, if(I"-14y.,г(,; j(3(:()ói.—, (4 цр -г ъ1-,рз 1 — г.у —, ) — г л исто;-.;()Й, ка -1.,; 1моге; —:,.;; -!(Ip ) IBT с l)BBг,,I";1 K((Л!г1Ч(с (",г1",М1 0 0.": :" 1 - (, г(С- -41 i l()уфера 30 . Г(,60" j г/ 1,1 г. (.;((Yi 0, 1 i/! КГ 1 0,0 !(/1 2-МЕркаптозтЗнОла .4 1 0% j! I церина (BH,61, ."-.)Кстракт с(".Ветляк); це:-..Грифугированием ;1!0000 g, I5 ((ин) и наносят, 3 микро(;ало(-. ку

;З00-400 м ((() ДсРНК-целл:олозы, Не орби25 ()Овавший" Я материдл (!Тмывагот 0,02 (ч

ГОИС Г1 (..I бгуфе(р10(г)1 .г(-(/, э, Реакцион(13Я сме(ь =ос гоит из 0,005 М

A7cр, 0п,0 ..-у1 (, 3 . Q., „ 2 г., р с-HCI pH

7гб, РВСТВОР ПГ!Да(от HB КОЛ;: IY!/ Со СКОРО

30 (.ть(О i!,5 мл/ч. Г)(родукть(реакции с участи I 1 ф 6 p fFI 8 (IT 3, и м м о б и л и 3 О В а н н О Г 0 н а .; Г 1 1-1, г "(O (j jiJ I Н те С П с1 П р), B T ОЛ И (-(jBL 8 H F! /i B T bi .::: Обладагот антивирус(4о(:: (1кт(1614ость о. г г (1ОЛуЧЕНИЕ ДСРь.K.-св 1Л(ог(ОЗЫ.

МикpoKI3!FII:та;.fi((1;8(„Ky(Г1 целлголозу промь(вагот дис, гиллирйванHc и водой, сднОВре менно уд(3(1яют -: елкие части ы с помошь(о

ДЕКаНТВЦИИ, за! 9М ЗТИЛОвс,М СПИР ГОM И ВЫС(/О(ИВВГО,! Г Г(ООО()1КВ jaf;Л(ОЛОВЫ СМЕ(Д fiaак)т с / мл 0 01! М ф(сс(()атнОГО б1!(()1зра ЗН

/ (г 6,;СЕО)КВ(1(г:--ГО 1(М;-/Мг;. IOB(/j, /1" Голи 1 И

0 з Р "«Л1 3 1/(I 1у(о " (. - ú(! Оаскла;;,,1; -г)- .(OЧ((11:, (jr !г г1д г -;- .гг(с. И; «(()13 ч с ;ВРУХ6 (грИ i:.i (Игга, !A; 6(г(. -,. :-. 4 г. - B 6 .6" .;(Ог4(1 1, г,,„-.((! B -;l,1-(ыЙ (;;-po6;-и. -IBЛ(; B Iol

- - Сl ЗтаНОЛОЬ(, 1 "(б(ЧЧВ(ГП 53К .=,11((1 (ЛЛНОЙ

УЛЬ" Г)(1())(((олетоввй Л(1 .1ПОЙ:; : Чи -! С Оа!.:", !ОЯния 50 см, ГIРсл6 испарения спирта про"

1 0 м(-!Ва(от 0,1 1 /11 хл(ООИДа на()1(1ч

+) ID(B>IlP (y -" -"- ИВИ" f "г(=" ((i (4OF. у

1.. 6 Р- i4 i Ú Л: г С Т Ь 3 i. j B .".:=, . а 4 (г С О 1311(3

l1" "i-.3са П(а ГЗ 33,.;Тг j-I((Ð. (Iз С(г(- "If сКИГси :>6::.а::.",-.:,н!/ из по.(О =»нuк HB-;ослт 5." мкл рас,3 г-,-ча;-,г.гг. 1 Его .(а.-..ъ,2 Ч(г.гМОР((,((СО=С.гс .-; .-1Й F . ЯОмс-*1(тг 13 Щзугг(го — (,(,(00!! 1 ; А 1 О1 B

;;.:,ЗСТВВOTBIH/i:;.T(3 атеМ "Ill!1!ji BBJ! (ОТ,",г(1 сг," ;J .1 ..3((.,. -:ервз " - Пеf(QBJ!4 .(г ИНОкуо г

- У-Ii

1701227 число некроэов. Антивирусную активность вычисляют по формулам

Нс Но

Х 100,о, если Но Но, Нс и

Н;, — Но

X 100 $ ., если Но Но, о где Но — число нек розов на половинке лис-: з, обработанного стандартным раствором; Но— испытуемым антивирусным веществом.

В ряде опь.тов число некроэсв преобразовывают по формуле

H -= Н./Н. х Н. Ср.

20 где Но P — среднее число некрозсв на листьях, обработанных стандартным раствором.

В таблицах и на рисунках приведены средние значения антивирусной активности или преобразованного числа некрсзов и доверительный интервал или наименьшее существенное оазличие (НСР) при 5 /-ной вероятности сшибки, В других случаях (ТЕ-1) с инфицировани=.;ì

УВК испытуемый и стандартный растворы наносят на противолежащие доли сложного листа растения-индикатора.

В табл.1 представлены результать. сравнения активности олигоаденилатсинтетазы из листьев картофеля и табака, индуцированных соответственно XBK и ВТМ.

Более высокая антивирусная активность получена при использовании фермента кар- тофеля иммунного сорта. 40

Использование растений картофеля в возрасте 1 месяца связано с тем, что более молодые растения не успевают набрать достаточное количество листовой массы. Этот возраст соответствует фазе начала бутони- 45 зации. В дальнейшем увеличение количества листьев замедляется, поскольку энергетические ресурсы растительного организма переключаются на накопление клубней, поэтому выращивание дольше 1 месяца не является целесообразным, Кроме того, после цветения листья грубеют, в условиях теплицы возможно их значительное отмирание.

Иифекционность индуцирующего виру- 55 са была выбрана со значительным избытком е AG сравнению с уровнем, необходимым для инфицирования восприимчивого растения (обычно 10 — 50 мкг/мл), Использование дурмана в качестве накопителя Х-вируса картофеля, как правило, обеспечивает концентрацию вируса в листовом экстракте (1:10) не менее 500 мкгlмл (по данным иммуноферментного анализа).

Использованная концентрация дсРНК (10 мкг/мл) близка к обычно используемым для инфицирсвачия концентрациям очиьценных вирусных препаратов (например, 10-50 мкг/мл для ВТМ). Данных а влиянии вели-в;ны молекулы дсРНК на индукцию интерфероноподобных белков или слигоаденилатсинтетазы в ра".,тительном оргзнизме не обнаружено. 8 животных тканях величина двуспиральнс:-:- участка, необходимая для активирования слигоаденилатсинтетаыл, составляет не менее 10 нукл от.-1дных пар.

Точная структура растительнь х олигоаденилатов не установлена.

Время сорбции фермента на дсРНК носителе составляет 2-4 v. Емкость носителя (количество белка, элюируемого с дсРНКцеллюлозы 1 M этаноламинацетатным буфером рН 7,6) составила 1,5-2 мг/r сырого ссрбента, П о и м е р 2. Динамика изменения активности олигоа„:,,:.:;илатсинтетазы картофеля после инокуляц Х- и Y-вирусами и дсРНК.

Способ получения препарата описан в при ",ере 1. Результаты опыта приведены в табл,2. Высокие значения активности фермент а получены 1же через 24 ч пссле инокуляции индуктора. В случае применения вирусов активност ферментногс препарата сохраняется пс крайней мере 7 дней. Индукция дсРНК столь же эффективна после 24часового инкубационного периода, однако в последующие дни несколько снижается.

Г р и м е р 3, Выяснение природы веществ, синтезируемых из АТФ в присутствии фесментативного препарата кастофеля, Для этого проводят хроматографию продуктов реакции на колонке ДЭАЭ-целлюлозы (2 с;1длина, 1 с диаметр), Нуклеотиды элюируют градиентом концентрации хлорида натрия (0-1 M), На хрсматограмме реакционной смеси (фиг.1), инкубированной в присут-:твии фермента из инфицированных ",ЗК растений, заметно появление четырех новых соединений, три из которых аблад-;ют антивирусной активностью flo крайней мере на од;-;ам из примененных растений-индикаторов, Синтезируемые соединения элюируются растворами хлорида натрия большей концентрации, чем АМФ и

АТФ, следовательно, отрицательный заряд

1701227 (H - H»)/H»,,, 15

Н /Нст х Нл

I j, cp этих веществ больше, чем у АТФ. Аналогичныее результаты получены и при разделении продуктов синтетазы, индуцированной дсРНК, Совпадение с ранее известными данными исследования соединений, синтезированных ферментом табака, свидетельс1вует о близости их свойств.

На фиг.2 представлены концентрационные зависимости антивирусной активности некоторых соединений, выделенных ионообменнсй хроматографией, Полученные данные свидетельствуют о высокой антивирусной активности продуктов реакции в концентрации 0,2-0,3 мкМ и более.

П р и и е р 4. Сравнение активности препаратов, полученных с помощью ХВК и дсРНК.

Для этого проводят:

1. Получение иммобилизованного на деРН К-целлюлозе фермента из листьев картофеля сорта Сафир. Испытывают следующие варианты инокуляции растений: соком дурмана, содержащим ХВК; 10 мкгlмл дсРНК (поли И-поли Ц); 0,01 М фосфатным буфером рН 7,6 (контроль), На колонку с аффинным сорбентом наносили экстракты 2—

5 г листьев картофеля в равном количестве

0,02 М трис-HCI буфера с 0,003 M MgSO<, G,1 M KCI, 0,01 M меркаптоэтанолом и 10 ным глицерином, 2. Синтез антивирусных веществ из

АТФ с использованием иммобилизованного фермента. Реакционную смесь (0,005 M

АТФ и 0,01 M MgSO<, 0,02 M трис-HCI pH

7,6) наносят на колонку со скоростью

0,5 мл/ч, На выходе получают раствор, содержащий антивирусные вещества, 3. Испытание антивирусной активности полученных соединений на половинках листьев Nikotiana glutlnosa, инфицированных

BTM. На одну из половинок листа растенияиндикатора наносят исследуемый препарат

=.а 3,5 ч до инокуляции вируса„на другую— стандартный раствор (исходная реакционная смесь, содержащая АТФ). Через 3 сут подсчитывают число некрозов на опытной и стандартной половинках листа, С целью исключения влияния различий в чувствительности листьев индикаторного растения к вирусу вычисляют преобразованную величину числа некроэов для каждого листа по формуле где Н;т — среднее число некроэов на половинках листьев, обработанных стандартным раствором;

Н и Нс число некрсэсв на половинках

1-го листа, обработанных соответственно

55 изучаемыми соединениями (Н», Ндс, H»i—

1 варианты инокуляции ХВК, дсРНК, контроль) и стандартным раствором.

Антивирусную активность вычисляют по формуле

Н вЂ” среднее число некрозов в вариантах

XBK и дсРНК, Н, — в контроле.

Для определения наличия Х-вируса картофеля в инокулирсванных растениях картофеля используют наборы для иммунсферментного анализа (ИФА) производства

НПО по картофелеводству и фирмы Верингер Маннхайм.

Полученные результаты представлены в табл,3, Антивирусная активность синтезированныхых веществ с применением фермента, индуцированного ХВК, 47, фермента, индуцированного дсРН К,57%. Исследование методом ИФА содержания ХВК в растениях картофеля, инокулированных инфекционным соком дурмана, показало отсутствие вируса, Пример 5. Определение количества препарата, полученного из разных иммунных к ХВК сортов картофеля.

В качестве меры количества (активности) ферментного препарата взято количество синтезируемого ферментом. веществ-олигоаденилатов, Для определения количества веществ

1-5 мл реакционной смеси наносят на микроколонку с 0,5 мл ПЭИ-целлюлозы (Serva, ФРГ), уравновешенной 0,02 М трис-HCI буфером рН 7,6, Колонку промывают 0 5 М хлоридом натрия в том же буферном растворе до значений Егвс меньше 0,01, Олигоаденилаты элюируют 1 мл 1% HCI и измеряют оптическую плотность Ezso полученных растворов. Аналогичные процедуры осуществляют в контрольном варианте, однако на колонку дсРНК-целлюлозы фермент не наносят, Количество выделенных веществ (нМ в

1 мл реакционной смеси) служит мерой активности фермента, Результаты представлены в табл,4, Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что препарат из картофеля сорта Сафир, инокулированного Х-вирусом картофеля, обладает наиболее высокой активностью. Хорошие результаты получены при применении листьев картофеля сорта Адретта, инокулированных Y-вирусом картофеля, а также сорта Сафир при инокуляции УВК, При использовании растений сорта Пересвет активность фермента была

1701227

Таблица 1

Индукция олигоаденилатсинтетаэы на листьях картофеля сорта Сафир Х-вирусом картофеля и табака Nicotiana glutiпоза вирусом табачной мозаики

Таблица 2

Динамика активности олигоаденилатсинтетазы картофеля после инокуляции ХВК, УВК, дсРНК (антивирусная активность продуктов ферментативного синтеза) значительно выше, что, вероятно, можно объяснить неоптимальными условиями проведения реакции, однако и в этом случае активность фермента несколько повышалась в инокулированных вирусами Х и Y растениях. В ранее проведенных опытах с использованием ферментного препарата из листьев дикого картофеля (ТŠ— 1), инокулированных УВК, количество продукта реакции в 1 мл реакционной смеси составило

1,9 нМ, а индуцированная вирусом антивирусная активность — 29) (при сравнении с ферментным препаратом из безвирусного контроля). Использованные сорта культурного картофеля обладают высокой полевой устойчивостью к вирусам, а сорта Сафир и

Пересвет — иммунитетом к ХВК и УВК соответственно. Измерения методом иммуноферментного анализа через неделю после инокуляции вирусами листьев растепий исследованных сортов наличия вирусов не показали.

Таким образом, предложенный способ при применении позволяет получить ферментный препарат, не содержащий вируса по сравнению с известными, и улучшить его

5 качество, Формула изобретения

Способ получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ, включающий инокуляцию растений виру10 сом, выращивание инфицированного растения, отбор листьев и получение из них экстракта. содержащего фермент, с последующей сорбцией фермента на афинном сорбенте,отл ича ю щийся тем, что, с

15 цел .ю упрощения способа и улучшения качества ферментного препарата, из растений используют иммунные к вирусам сорта картофеля, а инокуляцию осуществляют Х вирусом картофеля или двуспиральной РНК, 20 причем растения выращивают в течение 1 — 7 суток, а из сорбентов используют дсРНКцеллюлозу. а7 !

" 7

Е7.

О

<3

С7 <-7 " .

*.— (М О7

r„7 (ф с".! (7

Ы)

<О

О7

t) С7 ч (» 7

ll

«7. ). Ф а- (7 сч иэ - и о -

И7

„1 г-7 с- с — 7 :!! (!,! (! р !.>

:Т.

:у х «

2 !

77 . . х с.!

G.

Ъ.

Р7

07 K ! е;

Б (.7!

7.:

Б

Ф х

Б

С

Ф

О ! .7

О о

Ш

Я

М (О

М7 : lA ед

И

Q) !!

<.> и х

Таблица4

Анализ ферментных препаратов из различных

Б картофеля ктивноот (н М/мл .ной оа

BK

ВК

BV

Ко

1701227 о

-ь

Составитель Ю, Рогачев

Редактор Т.Пилипенко Техред М.Моргентал .Корректор Н.Король

Заказ 4487 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )К-35, Рауновская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101