Штамм бактерий bacillus sp.-продуцент @ - циклодекстринтрансферазы

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм Bacillus sp. BKM В-1973Д выделен из почвы Дуванского района Башкирии. Продуцирует / -циклодекстринглюканотрансферазу (ЦГТ-азу) на минеральных средах с небольшим количеством белковых добавок, используемых в качестве источников витаминов. Активность ЦГТ-азы в культуральной жидкости 30,5- 38,0 ед./л после 60-72 ч культивирования. 2 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

gs»s С 12 N 9!10, 1ДО

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ф к

° \ тО

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4827231/13 (22) 21,05.90 (46) 07.06.92. Бюл, ¹ 21 (71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения AH СССР (72) Н. Г.Усанов, О. Н. Логинов и А. И, Мелентьев (53) 557. I 8(088.8) (56) Патент США ¹ 4477568, кл, С 12 N 9/10, . опублик. 1984, Патент CLLIA № 4135977, кл, С 12 N 9/10, опублик. 1979. . Патент США № 3923598, кл. С 12 N 9/10; опублик, 1979, Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому штамму — продуцен-. ту циклодекстринглюканотрансферазы (а-1,4-глюкан-4-гликозилтрансфераза циклизующая, КФ 2.4.1.19; ЦГТ-аэа); фермента, который каталиэирует образование циклодекстринов из глюканов, перенося часть цепи 1,4-глюкана на нередуцирующий конец собственной молекулы и удаляя таким образом часть молекулы глюкана в форме кольца.

Известен штамм Bacillus circulans,,селектирующий ЦГТ-азу, которая преимущественно образует Р -циклодекстрин.

Существенный недостаток этого штамма в том, что он, кроме ЦГТ-азы, продуциру-. ет протеолитическиа ферменты, которые значительно снижают активность ЦГТ-аэы, гидролизуя ее. При использовании ЦГТ-азы, продуцируемой B. clrculans.. необходимо избавляться от протеаз, что является дорогим и трудоемким процессом.,, Ы,, 1738852 А1 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SP. — ПРОДУЦЬ HTP ÖÈ КЛОДЕ КСТРИНТРАНСФ ЕРАЗЦ (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм Bacillus sp. ВКМ

В-1973Д выделен из почвы Дуванского района башкирии. Продуцирует Р-циклодекстринглюканотрансферазу (ЦГТ-аэу) на минеральных средах с небольшим количеством белковых добавок, используемых в качестве источников витаминов. Активность

ЦГТ- аэы в культуральной жидкости 30,5—

38,0 ед./л после 60 — 72 ч культивирования. 2 табл., 1 ил.

Известны. пять алкалофильных штаммов

Bacillus sp. 38-2, ВасНЬз sp. 135, Bacillus

sp. 169, ВасИЬз sp. 13, Bacillus sp. 17-1, а также штамм В. megaterium Тб, продуцирующие ЦГТ-аэы, образующие преимущест- . венно Р-циклодекстрин, Недостатком известных штаммов явля- (Д ется то, что они обладают невысокой про- Q) дуктивностью по ЦГТ-азе. При этом они р способны к секреции ЦГТ-.азы только на у сложных питательных средах, содержащих большое количество белковых компонентов, таких как пептон, дрожжевой экстракт (автоанаат), концентрированный. настой ае- а рен кукурузы и т.д., что повышает стоимость процесса ферментации.

Целью изобретения является получение нового алкалофильного штамма, обладающего высокой продуктивностью по ЦГТ-азе, преимущественно образующей Р-циклодекстрин.

1738852

45 отсутствует; индол не образует; дегидроксиацетон не образует; рост в питательном бульоне с 5 и 7% йаС1 отсутствует; услоция роста; рН среды 7,0-10,0, температура 2046 С. Штамм 6.6.3(ВКМ В-1793Д) продуци- 50 рует на жидких средах . ЦГТ-аэу, образующую преимущественно Р -цикладекстрин. Условия хранения: периодически выращиваемая культура инкубируется на картофельно-глюкозном агаре рН 9,0, при 55 . температуре 37-40 С в течение 4 сут, хранится на этой же среде при 4 С.в течение 6 мес.

Штамм Bacillus sp. 6,6.3 (BKM В -1793Д) был испытан и лабораторных условиях.

Предлагаемый штамм.Bacillus зр. 6,6.3 депонирован во, Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером BKM Б1793Д, продуцирует ЦГТ-азу, преимущественно образующую P -.циклодекстрин, на минеральной среде с небольшим количеством белковых добавок в качестве источников витаминов, с высокой активностью.

Штамм выделен .иэ почвы Дуванского района Башкирии.

Культурально-морфологические при.знаки..Единичные, иногда в парах, палочки шириной 0,5 — 0,7 мкм, длиной 2 — 5 мкм. Окраска по Граму — вариэбельна, клетки образуют споры в спорангии — центральная или терминальная, клетки подвижны. Штамм при росте на мясопентонном агаре через 48 ч при 37 С образует единичные колонии с четким, ровным краем, размером в диаметре 3 — 6 мм, поверхность колонии гладкая, колония полупрозрачная, белесая. При росте на картофельно-глюкозном агаре (рН 9,0) штамм образует через 48 ч при 37 С единич-ные колонии с ровным краем, размером 4 — 9 мм, поверхность колонии гладкая консистенция вязкая (на МПА маслоподобная), профиль колонии. выпуклый (на MflA плоский), колония полупрозрачная, матово-белесая.

Биохимические признаки.

Реакция Фогес — Проскауэра отрицательная; каталазная активность положительная; энаэробный рост слабый; штамм образует кислоту при росте на углеводах— глюкозе, ксилаэе, рибозе, мальтазе, лактазе, эрабинозе, раффинозе, мелицитозе, рамнозе, галактозе, сахароэе,и спирте-иназите; газ из выше приведенных углеводов и спирта не образует; гидролиэует крахмал; очень слабо гидролизует казеин и желатину; цитрат и пропианат не утилизирует; тирозин и фенилаланин не разлагает; восстанавливает нитраты; реакция на лецитиназу

Пример 1. Инокулят штамма Bacillus

sp. 6.6.3 (BKM В-1793Д), выращенный на чашках Петри с картофельно-глюкозным агаром (рН 9,0) в течение 7 сут при 37 С, смывают стерильной водой из расчета 10 мл воды на одну чашку и вносят в колбы объемом 500 мл, содержащие по 100 мл стерильных сред..

Состав сред приведен в табл. 1 (соотношение инокулята и питательной среды 1:10, культивирование осуществляют на качалках со скоростьй встряхивания 180 мин, температура выращивания 37 С).

Через каждые 12 ч культивирования отбирают пробу культуральнай жидкости в которой определяют ЦГТ-аэу известным методом.

Динамика накопления ЦГТ-азы в культуральной жидкости приведена в табл. 2, В пробах, отобранных через 48 и 96 ч культивирования, измеряют пратеазную активность известным методом. Штамм Bacillus

sp. 6.6.3 на средах А, В и С не продуцирует протеазы.

Пример 2. Специфичность ЦГТ-аэы определяют по продуктам реакции этага фермента с крахмалом. Анализ продуктов ферментативнай конверсии крахмала проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия реакции: 2 мл 3%-ного раствора крахмала в 0,05 М трис-HCI буфере, рН 8,0 смешивают с 1 мл раствора фермента, смесь помещают в термастат на 30 мин при температуре 40 С.

Реакцию астанавл:.>веют нагревам смеси да

100 С в течение 3 мин. Условия храматографиравания:,элюент — 65%-ный водный ацетанитрил, колонка для разделения продуктов реакции SEPARON NH2, детектор — дифференциальный рефрактометр, скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, хроматаграмма продуктов реакции представлена на чертеже. Соотношение продуктов конверсии крахмала ЦГТ-азой штамма Bacillus sp.

6.6.3(В КМ Б-1793Д) составляет, %. ц -циклодекстрин 6,0;Р -циклодекстрин 83,0; g-циклодекстрин 11,0. В реакци о вступило 92% крахмала. В качестве раствора фермента используется культуральная жидкость выращенного на среде С штамма 6,6.3, разведенная в 5 рэз буфером 0,05 М трисHCi, рН 8,0, Таким образом, штамм Bacillus sp. 6.6.3 (ВКМ В-1793) обладает более высокой продуктивностью по ЦГТ-азе на сложных питательных средах, чем известные алкалофильные штаммы, а также, продуцирует ЦГТ-азу в значительных количествах

1738852

Таблица 1

Г1 р M и е ч а н и е. Вода дистиллированная до 1л доводится во всехсредах после навески =ev компонентов.

Таблица 2 (807 от максимальной продуктивности) на среде с небольшим количеством белковых добавок в качестве источников витаминов, что позволяет экономить дорогие компоненты питательной среды: пептон и дрожжевой автолизат экстракт в 80 раз и концентрированный настой зерна кукурузы в 800 раз с учетом снижения активности культуры при выращивании на этой среде, Кроме того, штамм 6.6.3 не обладает протеазной активностью, культура продуцирует

ЦГТ-аэу, образующую преимущественно циклодекстрин, который имеет наибольшее

5 применение в фармакологии, медицине, пищевой промышленности и других областях индустрии.

Ф ор мул а изобретения

10 Штамм бактерий Bacillus sp. BKM В1793Д вЂ” продуцент Р-циклодекстринтрансферазы.

1738852. Составитель С. Субботина

Техред M.Ìîðãåèòàë Корректор О. Кравцова

Редактор В. Петраш

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1978 Тираж. Подписное

ВН 1ИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5