Реагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов

 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к реагентам для определения ферментативной активности микробов. С целью повышения чувствительности реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов последний помимо субстратанатриевой соли органической кислоты, индикатора - бромтимолового синего и забуференного физраствора СРЕдСТВОН 5,4-5,6, дополнительно содержит сухой гидролизат казеина и желатин при следующем соотношении компонентов, мас.%: субстрат 0,9-1,5

сухой гидролизат казеина 0,8-1,2

желатин 0,8-2,0

бромтимоловый синий 0,04-0,06

забуференный физраствор СРЕдСТВОН 5,4-5,6 - остальное. Реагент обладает повышенной чувстивтельностью и позволяет определить соответствующую активность микробов при концентрациях 10-100 микробных клеток в 1 мл в течение 7-9 ч, а при концентрациях более 1 млрд/мл - в течение 2-5 ч. Реагент предназначен для биохимической дифференциации микробов кишечного семейства и удобен в походно-полевых условиях, т.к. его использование может исключать этап накопления чистой культуры, что ведет к уменьшению сроков получения результатов анализа. 7 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SUø 147250

ceo 4 С 12 Q 1/00, С 12 11 9/10!

1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4259138/28-13 (22) 09,06,87 (46) 15.04.89. Бюл. № 14 (71) Кишиневский государственный медицинский институт (72) Ф.И.Георгица, В.М.Никитин и А,П.Каланча (53) 577,15(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹- 1364636, кл ° С 12 11 1/00, 1986 °

Андреева З,И. и др. Система индикаторная бумажная для ицентификации энтеробактерий. )IQ43M, 1983, ¹ 4, стр. 20-23, (54) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЦЕТАТА3bi, ЦИТРАТАЗЫ И МАЛОНАТАЗЫ МИКРОБОВ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к реагентам для определения ферментативной активности микробов. С целью повышения чувствительности реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, последний помимо субстрата — натриевой соли органической

Изобретение относится к микробиологии, а именно к реагентам для определения ферментативной активности микробов, Цель изобретения — повьппение чувствительности реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонагазы микробов, Сущность изобретения заключается в том, что реагент содержит субстратгидролизат казеина сухой, желатин физраствор и бромтимоловый синий при следующем соотношении компонентов кислоты, индикатора — бромтпмолового синего и забуференного физраствора с рН 5,4-5,6, дополнительно содержит сухой гидролизат казеина и желатины при следующем соотношении компонентов, мас.7.: субстрат 0,9-1,5; сухой гидролизат казеина 0,8-1,2; желатин

0,8-2,0; бромтимоловый синий 0,040,06; забуференный физраствор с рН 5,4-5,6 — остальное, Реагент обладает повышенной чувствительностью и позволяет определить соответствующую активность микробов при концентрациях 10-100 микробных клеток в 1 мл в течение 7-9 ч, а при концентрациях более 1 млрд/мл — в течение 2-5 ч.

Реагент предназначен для биохимической дифференциации микробов кишечного семейства и удобен в походно- олевых условиях, т.к. его использование может исключать этап накопления чистой культуры, что ведет к уменьшению сроков получения результатов анализа.

7 табл, 2 мас.7.: соль органической кислоты (ацетат натрия-, цитрат натрия, малонат натрия) 0,9-1,5; гидролизат казеина сухой 0,8-1,2; желатин 0,82,0; бромтимоловый синий 0,04-0,06, забуференный физраствор рН 5,4-5,6 остальное, Для получения реагента растворяют в физрастворе соль органической кислоты (ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия), гидролизат казеина, затем добавляют растворы желатина и бромтимолового синего, полуj 472506

П р и м е, р 1,.Из листа бумаги с полимерной пленкой вырезают диск диаметром 10 см. На пленочной поверхности расчерчивают 3 ряда по 5 зон площадью, 2,0 х 1,5 см (1 ряд зон для реагентов на ацетатазу, 2 ряд — на цитрата зу, 3 ряд — на малона тазу) . В 1 пробирку берут навеску порошков ацетата ченную смесь реактивов наносят на— гидрофобную поверхность полимерной пленки в виде капель, которые полимеризуются высушиванием при комнат5 ной температуре. Соль органической кислоты (ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия) вводят в реагент в качестве специфического субстрата, бромтимоловый синий играет роль индикатора рН реакции, указываюший на образование щелочных продуктов при ферментации субстрата ферментом микробов. Желатин способствует фиксации компонентов реагента к гидрофобной поверхности полимерной

1 пленки и одновременно вместе с гидролизатом казеина и субстратом служат питательными веществами для микробов, Это приводит к росту и размно- 2р жению микробов, а следовательно, при наличии у последних специфических ферментов (ацетатазы, цитратазы, малонатазы), к увеличиванию их количества (массы), что способствует ус- 25 корению ферментации субстратов и повышению чувствительности реагента.

Это дает возможность определить ацетатазу, цитратазу и малонатазу 10.100 микробных клеток в 1 мл в тече- tgp ние 7-9 ч, Бумага с гидрофобным полимерным покрытием служит носителем реагентов. Это создает возможность контакта микробной культуры с реагентом в микрокаплях, приводит к быстрому растворению ингредиентов и ферментации субстратов соответствующими ферментами микробов, В табл.1 представлена чувствитель" ность реагента для определения ацета- 40 тазы, цитратазы и малонатазы микробов.

Реагенты, содержащие ингредиенты вне пределах граничных значений, имеют более низкую чувствительность, 45

В табл.2 представлена чувствительность реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов в зависимости от количественных соотношений ингредиентов. натрия 0,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 r во 2 пробирку — цитрата натрия 0,1 r и гидролизата казеина сухого 0,1 г,, в 3 пробирку — малоната натрия 0,1 r и гидролизата казеина сухого 0,1 г. Параллельно готовят растворы желатина и бромтимолового синего, Для приготовления раствора желатина 10Х-ного в 4 пробирку вносят навеску желатина пищевого (ГОСТ

11293-78) (1,0 г) и заливают дистиллированной водой (9,0 мл), выдерживают 60 мин, нагревают, не доводя до кипения, при непрерывном помешивании

/ стекляной палочкой до полного растворения, Для приготовления раствора бромтимолового синего 0,5Е-ного в

5 пробирку вносят навеску порошка бромтимолового синего Водорастворимо (Ту 6-09-2045-,77) (0, 05 r) и залиВают дистиллированной водой (10,0 мл), встряхивают до полного растворения. Затем в 1; 2, 3 пробирки вносят растворы желатина 103-ного и бромтииолового синего 0,57. по

1,0 мл и забуференного физраствора рН 5,4-5,6 по 7,8 мл. Пробирки со смесями ингредиентов помещают на водяной бане при 80 С, Полученные растворы охлаждают до комнатной температуры, после чего их наносят по 1 капле объема 0 02 мл в центр каждой зоны соответствующего ряда диска (раствор с ацетатом натрия из 1 пробирки наносят в зоны 1 ряда, раствор с цитратом натрия из 2 пробирки — в зоны

2 ряда и раствор с малонатом натрия из 3 пробирки — в зоны 3 ряда). После этого, диск оставляют при комнатной температуре до полного высыхания капель и получения фиксированных микропленочных реагентов, Готовые реагенты хранят в полиэтиленовых мешочках при комнатной температуре.

По мере надобности реагенты используют для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, С этой целью диск помещают в чашку Петри, а на поверхность реагентов наносят по 1 капле изучаемой микробной культуры, содержащей от 10 †1 клеток и более в 1 мл физраствора рН

6 5, При этом, можно изучить как микробную культуру со скошенного агара, так и колонию, Чашку закрывают и ино кубируют при 37 С. При положительной

06 формула и э о б р е т е н и я

0,8 — 1,2

0,8-2,0

Остальное таблица l

Количес во микро вык кле ток в

1 ил

Субстрат и время его фереяеитации, я

Й Г Г?Л Q лоиат натрия

3.4 5(617 8 9

101

103

106

10 - +

+ +4 ++

+ ++ ++

+ ++ ++

+ ++ ++

+ ++ ++

+ ++ ++

+.н ++

+ ++ ++

+++нг 4 ++ ++

+ ++ ++

++

++

Н++

++

++ +

t ++ ++

+ ++ ++

+ ++

+ ++ ++

++ н н

++ ++ ++

+ +

+ ++ ++ б+ ++

+ ++ ++ ++ ++ ++

++ ++ ++ н ++ ++

++ ++

++ ++

+ ++

+ ++ ++

4 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

+ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

++нн

++ ++ ++

++

++

++ ++ ++ н ++ ++

++ ++ н н

П р и и е ч а и и е. ++ Реакция лолояительиая, + реакция слабололокительиая, — реакция отрицательная, 5

14725 реакции, как результат ферментации ацетата натрия, цитрата натрия или малоната натрия, цвет капли переходит из желтого в синий, а при отрицательной реакции остается без изменений, Пример 2. В табл.5, 6, 7 представлены результаты испытания предложенного реагента для конкретных штаммов микроорганизмов. 10

В табл.3 дана чувствительность реагента и системы индикаторной бумажной с цитратом натрия.

Чувствительность реагента и системы индикаторной бумажной с малонатом натрия представлена в табл,4.

Pseudomonas eruginosa АТСС27853, Citrobacter freundi I2ООО1, Xlebsiel—

la pneumoniae 180104 — продуцентов ацетатазы, малонатазы и цитратаэы, пока- 20 зывающие более выгодную чувствительность реагента по сравнению с известным. !

Реагент для определения ацетатазы, 25 цитратазы и малонатазы микробов позволяет определить ацетатазную активность, цитратазную активность и малонатазную активность микробов при концентрациях от 10-100 микробных 30 клеток в 1 мл в течение 7-9 ч, а при концентрациях более 1 млрд/мл — в течение 2-5 ч.

Предлагаемый реагент предназначен для ускоренного определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы при биохимической дифференциации микробов кишечного семейства и других, и обладает значительно повышенной чувствительностью. Кроме того, реагент более удобен для применения в лабораторной практике, особенно, в походно-полевых условиях и при массовых исследованиях, так как его использование может исключать этап накопления чистой культуры, а следовательно, и уменьшаются сроки получения результатов анализа.

Рвагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, включающий субстрат — натриевую соль органической кислоты, эабуференный физраствор с рН 5,4-5,6, и индикатор— бромтимоловый синий, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности, он дополнительно содержит сухой гидролизат ка-. зеина и желатин при следующем соотношении компонентов, мас.Е:

Натриевая соль органической кислоты 0,9-1,5

Сухой гидролизат казеина

Желатин

Бромтимоловый синий О, 04-0, 06

Забуференный физраствор с рН 5,4-5,6

1472506

Таблица 2 идроливат ка Желатин Вромтимо- Интенсивность реакции ферментации и конеина сухой ловый центрация микробов синий б т 6 х б o !о Po(io Т!О Iio 1!0 1! 1 ) !О

0,02

0,ОЗ

0,04

0,045

0,05

О!055

0,06

0,065

0,07

0,6 0,6

О,Л О,В

0,8 0,8

0,9 0,9

1 ° 0 1,0

111 lo!

1,2 1,2

1i3 1,3

1,5 1,5

-+ +

+ + +

4 + +

++ ++ ++ ++ ++, ++ ++ ++ ++

++ ++ н ++ ++ ++ ++ ++ . ++

++ ++ ++ ++ ++ ++

++ ++ ++

++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

++ ++ ++ ++ ++ Ф+ ++ ++ ++

+ + + + + +

+ + +

Таблица 3

Концентрация микробов в ) мл и количество испыЧувствительность

Статистические показатели

Из них положительных таиных культур ферментирующих цитрат натрия с системой в реагентом ябс, абс. % + п, % +m

93,313, 7

93,3+ 3,7

93,3+3,7

95,5+3,1

97,7+2,2

100, 0 0, О

100,0+0,0

100,01.0,0

)00,0+0,0

100, О+О, О

П р и м е ч а н и е, Результаты ферментации натрия учитывались через 9 ч о инкубации при 37 С, Т а б л и ц а 4

Чувствительность

Концентрация микробов в 1 мл и количество испытанных культур ферментирующих малонат натрия!

; Статистические показатели

Из них положительных!

Р" с системой с реагентом абс.

Г абс.

10 /13

10 /13

10 /13

10 /13

10 /13

10 /13

10 /13

108/)3

10 /13

5х 10 /13

) 00,0+0,0

100,0+О, О

100, ОйО, О °

100 О+0,0

100, О+О, О

100,0+О, О

100,0+О, О

100,0+0,0

100,0+0 О

100,0+0,0

П р и м е ч а н и -е. Результаты ферментации малоната натрия учитывались о 1 через 9 ч инкубации при 37 С, h 07 07

Б 08 ОВ

1 09 09

2 0,9 0,9

1,0 li0

4 1,2 1,2

5 15 15

В 16 16

Г 1,7 1,7

1О /45

10 /45

10 /45

10 /45

10 /45

10 /45

10 /45

106 /45

10 /45

5x)0 /45

42

42

42

43

44

13

13

13

13

13

13

13

13

13

О;6

0,7

0,8

0 9

1,0 ,1,5

2,0

2,!

2,2

0,6

ОФ 7

О,В

0,9

1,0

l,5

2, О

2, 1

2, 2

0,02

О,ОЭ

0,04

0,045

0 05

0,055

0,06

0 065

0,07

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О

13

G

О

О

О

О

О

О

О

33,3 7,0

33,3+7,0

О

О

О

О

О

О

G

100, О+0, О

100,0 .0,0

25,7

25,7

25,7

30,8

44,4

О

О

О

9,5

9,5

О

О

О

О

О

О

О

О

О

О, 001 . 0,001

0,001

0,О01

0,001

0,001

0,001

0,001

0,001

0,001

О, 001

0,001

0,001

0,001

0,001

О) 001

О, 001

0,001

О, 00)

0,001

147 "506

Таблица 5

Ко

Скорость ферментацин ацетата натрия

Система индикаторная бумажная Геагент ток

l0

1ОУ

10т

I Pa

1О

3х10

++ ++ ++

++ ++ ++

++ ++ ++

+ ++

++

++ ++

++ ++

+ ++ ++ ++ ++ ++

+ ++ ++ ++ ++ ++ ++

+ ++ ++ н ++ ++ ++ ++

++ ++ н ++ н ++ ++ н н ++ н ++ ++ ++ н ++

+ + ++ ++

++

+ ++ ++ ++

I Таблица 6

Концентрация микробнмк кле

Скорость ферментацни цитрата натрия

Реагент

4 ч 5 ч

Система индикаторная бумажная

2чЗч бч7ч8ч9ч24ч ток я!

IO.

О!

1От

lO

I0s

lO

1О .3xI O т ++

+ н

+ ++

+ ++.

++ ++

++ ++

++ н

++ ++

+ н ++ ++

+ +

++ н

++ ++

++ н н н н н

++ ++

++ ++

++ ++

++ ++ и ++

+ н н н ++ ++

++ ++

++ ++

++ ++

++ ++ н

Таблица 7

Скорость ферментацни малоната натрия

Концентрация

Система индикаторная бумажная

lч чЗч4ч$ч ч7ч8ч ч24 ч

Реагент микробных клеток в мл

lO

lO

1О

I 0

l 01

10е

Зх10! ч2чЗч4ч5чч7ч8ч9ч24ч

+ ++ ++ ++

+ ++ ++ ++

+ ++ ++ ++

+ ++ ++ ++

+ ++ ++ ++

+ ++

+ + ++ и ++

++ ++

++ ++

++ ++

+ ++

++ ++

++ ++

++ -++

++ ++

++ ++

++ ++ ++

++ ++ ++

++ ++

+е

+ н

++ ++

++ ++ ++ ++ ++

+ ++

Составитель В.Соина

Редактор И.Сегляник Техред Л.Сердюкова Корректор В.Романенко

Заказ 1674/28 Тираж 501, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101