Способ определения суммарной протеазной активности панкреатического сока
Изобретение относится к медицине, а именно к клиническим лабораторным исследованиям . Цель изобретения - сокращение времени анализа и повышение точности определения . Сущность изобретения: преинкубация образца панкреатического сока .с раствором тромбина и определение тромбинового времени после добавления к аликвоте этой смеси донорской свежей цитратной плазмы, уровень которого сравнивают с аналогичным показателем, определенным для стандарта с известной протеазной активностью. Изобретение позволит в 1,5 раза повысить точность определения и в 1,5 раза ускорить проведение анализа.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СО1 ИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫ И КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4717235/14 (гг) 11.07.89 (46) 15.06.92. Бюл. йв 22 (71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей (72) Г.М, Тебенчук, Г.Н. Липкан, В,Д. Лукашук, В.М. KpaxManes, Г.И. Литвиненко. В.Н, Терлецкий и С.Я. Кубраченко (53) 615.475 (088.8) (56) Богер М,М. Методы исследования поджелудочной железы. Новисибирск: Наука, 1982, с. 89-91. (54) СГ10СОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ ПРОТЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО СОКА
Изобретение относится к медицине, а именно к клиническим лабораторным методам исследования.
Известен способ определения протеолитической активности панкреатического сока по расщеплению трипсином того или иного субстриа, например N-бенэоил-D-аргинин-паранитроанилида, Однако спектрофотометрическое определение кинетики ферментной реакции с образцом мутного дуоденального содержимого затруднено из-эа сниженной точности установления концентрации конечного продукта реакции — n-нитроанилина, Цель изобретения — сокращение времени анализа и повышение точнос1и определения.
Пос.тавленная цель достигается путем преинкубации образца панкреатического сока с раствором тромбина и последующим определением тромбинового времени после добавления к смеси донорской свежей
Ы1 1741080 А1 (Я)з 6 01 N 33/68. А 61 К 35/00 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к клиническим лабораторным исследованиям. Цель изобретения — сокращение времени анализа и повышение точности определения. Сущность изобретения: преинкубация образца панкреатического сока с раствором тромбина и определение тромбиноваго времени после добавления к аликвоте этой смеси донорской свежей цитратной плазмы, Уровень которого сравнивают с аналогичным показателем. определенным для стандарта-с известной протеазной активностью. Изобретение позволит в 1,5 раза повысить точность определения и в 1,5 раза ускорить проведение анализа, цитратной плазмы. значения которого сравнивают с аналогичным показателем, определенным для стандарта с известной поотеазной активностью. пй
Способ осуществляют следующим образом. ф
А, Построение калибровочной. кривой.
1. 1 таблетку фармакологического пре- С) парата "Панкреатин" (Финляндия) или Q) аналогичного препарата с протеазной активностью 12500 ед. осторожно растирают в ступке, растворяют в 12,5 мл 0,97,-ного раствора натрия хлорида и встряхивают в течение 15 мин. Суспензию переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют
10 мин при 2000 g. К 8 мл супернатанта добавляют 2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Таким образом получают исходный стандартный раствор с протеазной активностью 800 ед/мл, Из этого раствора методом Серийных разведений готовят
1741080
Т омбиновое в емя, с 170 152 128 87 64 42
Протеазная активность,enr 200 100 50 25 12,5 6,25 Способ определения суммарной протеаэной активности панкреатического сока, 45 включающий исследование дуоденального содержимого, отличающийся тем. что, с целью сокращения времени анализа и повышении точности определения, в качестве субстрата используют 10%-ный раствор 50 тромбина, который инкубируют с пробой в соотношении 1:1 в течение 15 мин при 37 С, . затем к аликвоте из этой смеси добавляют равный объем свежей цитратной плазмы, стабилизированной по .тромбиновому вре55 мени, определяют тромбиновое время, уростандартные растворы активностью 400; 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 ед в 1 мл. 2. Готовят раствор тромбина 1 г/л, растворяя 10 мг тромбина в 10 мл буфера Михаэлиса (рН 7,35), . 3. Свежецитратную, смешанную от нескольких пациентов плазму стандартизируют, добавляя к ней необходимое количество 0,9%-ного раствора хлорида натрия с таким расчетом, чтобы тромбиновое время плазмы стало 15 — 18 с. 4. В пробирки Вассермана после маркировки (% 1,2,3,4,5,6) вносят по 0,2 мл стандартных растворов с протеазной активностью 200; 100; 50; 25: 12,5 и 6,25 ед/мл. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл раствора тромбина (1 мг!мл), инкубируют в течение 15 мин на водяной бане при 37 С, затем пробы охлаждают в воде или в ледяной бане. 5. Из каждой пробирки отбирают 0,2 мл смеси в пробирку Вассермана, прогревают 1 мин на водяной бане при 37, добавляют 0,2 мл свежецитратной плазмы и измеряют сразу тромбиновое время. Это повторяют дважды для каждой пробы смеси и рассчитывают среднее тромбиновое время для каждого уровня протеазной активности. Если используется одна серия тромбина и готовится свежецитратная плазма с одним и тем же постоянным тромбиновым временем, например 15 с, то калибровочную кривую можно использовать многократно, .Б. Исследование образца. 1. Разводят пробу панкреатического сока в 10 раз 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Доводят рН исследуемой пробы до 7,35 растворами 0,1 н соляной кислоты или 0,1 н гидрооксида натрия. 5. Строят калибровочную кривую на основании полученных результатов. 6. Измеряют согласно методике среднее тромбиновое время соответствующего образца, Оно оказалось равным 78 с. По калибровочной кривой находят соответствующую этому времени протеазную активность, которая равна 24ед/мл. Учитывая разведение, суммарная протеазная активность образца составляет 240 ед/мл, Использование способа позволит в 1,5 раза повысить точность определения и в 1.5 раза ускорить проведение анализа. 2, К 0,2 мл пробы добавляют 0,2 мл раствора тромбина 1 r/ë и инкубируют эту смесь 15 мин при 37 С на водяной бане,,Охлаждают смесь на ледяной бане. 3. К 0,2 мл смеси добавляют 0,2 мл свежецитратной плазмы и отмечают тромбиновое время. Процедуру повторяют еще раз, предварительно выдержав смесь 1 мин при 37 С на водяной бане, 4, Используя среднее по двум анализам значение .тромбинового времени, находят соответствующую данному образцу протеазную активность по калибровочной кривой с учетом разведения, Пример. Определение суммарной протеазной активности пан креатического сока. 1. Образец панкреатического сока (5 мл), полученный после дуоденального зондирования с использованием двухканального зонда, разводят в 10 раз, добавив 45 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Исходное рН образца равно 7.2, Доводят рН образца до 7.35 с помощью 0,1 н раствора NaOH. 2, Готовят стандартные растворы препарата "Панкреатин" и раствор тромбината 1 г/л согласно описанной методике. 3. К свежецитратной смешанной от 5 пациентов плазме, тромбиновое время которой без разведения было 10 с, постепенно добавляют 0,9%-ный раствор NaCI, пока ее тромбиновое время не станет равным 15 с. 4. Используя эту плазму, по описанной методике измеряют тромбиновое время стандартных растворов "Панкреатина" (200; 100; 50; 25; 12,5 и 6.25 ед/мл). Получают следующие данные: Формула изобретения 1741080 Составитель Г.Тюнина Техред М.Моргентал Редактор М.Циткина Корректор - Т.Ваш Заказ 2083 Тираж Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 вень которого сравнивают с аналогичным показателем, определенным для стандартного ферментного препарата с известной протеазной активностью.
