Способ определения альбумин-глобулинового коэффициента крови
Изобретение, относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и касается определения альбумин-глобулинового коэффициента (АГК) в плазме или сыворотке крови. Цель изобретения - упрощение способа пр.и одновременном повышении его чувствительности. Кровь, плазму и сыворотку разводят буферным раствором/, отделяют (в случае крови) форменные элементы, добавляют флуоресцентный .краситель фенил-1-амино-8-сульфонафталин (АНС), измеряют интенсивность собственной флуоресценции в исследуемом и контрольном образцах до и после добавления АНС и рассчитывают величину АГК по формуле. В качестве контрольного образца используют раствор триптофана. Для проведения анализа по описанному способу достаточно 2- 40 мкл крови или 1-20 мкл плазмы или сыворотки (т.е. чувствительность возрастает на 1-2 порядка), нет необходимости в проведении раздельного определения количества альбумина и глобулинов. Время анализа одной пробы по предлагаемому способу .1-2 мин. сл
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я>s G 01 N 33/52, 33/68
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Е 0
АГК= К-2
Б С
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 47845.60./14 (22) 18.01.90 (46) 15.03.92. Бюл. М 10 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РСФСР (72) P. К. Айдыралиев и Г. Е. Добрецов (53) 612.015(088.8) (56) Лабораторные методы исследования в клинике /Под ред. В. В. Меньшикова. М.:
Медицина, 1987. с. 174-176. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬБУМИНГЛОБУЛИНОВОГО КОЭФФИЦИЕНТА
КРОВИ (57) Изобретение, относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и касается определения альбумин-глобулинового коэффициента (АГК) в плазме или сыворотке крови. Цель изобретения — упрощение способа при одновременном повышении его
Изобретение относится к медицине, а точнее к клинической биохимии, и касается определения ал ьбумин-глобулинового .коэффициента (АГК) в плазме или сы"воротке крови с диагностической целью, АГК вЂ” величина, выражающая отношение количества альбуминов к количеству глобулинов в биологических жидкостях, В норме АГК крови колеблется в пределах 1,2-2,0. При разнообразных патологических состояниях (хро. нические инфекции, заболевания печени, почек, ожоги, воспаления и т.д.) наблюдается снижение АГК крови — и это служит важным диагностическим признаком.
„„ЯЦ„„1720004 А1 чувствительности. Кровь, плазму и сыворотку разводят буферным раствором, отделяют (в случае крови) форменные элементы, добавляют флуоресцентный краситель Nфенил-1-амино-8-сульфонафталин (АНС), измеряют интенсивность собственной флуоресценции в исследуемом и контрольном образцах до и после добавления АНС и рассчитывают величину АГК по формуле. В качестве контрольного образца используют раствор триптофана. Для проведения анализа по описанному способу достаточно 240 мкл крови или 1-20 мкл плазмы или сыворотки (т.е. чувствительность возрастает на 1-2 порядка), нет необходимости в проведении раздельного определения количества альбумина и глобулинов. Время анализа одной пробы по предлагаемому способу 1 — 2 мин.
С":
М
Цель изобретения -упрощение способа: ) при одновременном повышении его чувствительностии.. (З
Способ осуществляется следующим образом.
Пробу крови разводят в 50-1000 раз, отделяют форменные элементы, не полученного раствора плазмы готовят четыре пробы, в которых измеряют интенсивность флуоресценции (ее величины обозначены как Е, Б, С и Д) и рассчитывают АГК по формуле
1720004 где Š— интенсивность собственной флуоресценции разбавленной плазмы;
Б — то же, в присутствии N-фенил-1-амино-8-сульфонафталина (АНС) в конечной концентрации 20 — 60 мкМ; 5
С вЂ” интенсивность флуоресценции 1050 мкМ раствора триптофана;
Д -тоже в присутствии 20-60 мкМ АНС; . К- числовой коэффициент, который npvi средней концентрации АНС 40 мкм состав- 10 ляет величину 2,13.
Коэффициент К связан с концентрацией
АНС следующим уравнением:
К = 2,25 (1 — 0,0013 Н). 15 где Н вЂ” концентрация АНС в мкМ.
Обычно используют концентрацию АНС
40 мкМ, и в уравнениях расчета АГК используют коэффициент, равный 2,13. В интерва- 20 ле концентраций 20-60 мкМ даже при использовании постоянного коэффициента (2,13) ошибка определения АГК находится в пределах й7;4. Если же использовать переменный коэффициент, то значения АГК пол- 25 учаются практически одинаковые.
Результаты приведены в таблице, В предлагаемом способе можно также использовать цельную плазму или сыворотку. которую перед измерениями необходи- 30 мо развести в 100-2000 раз (это соответствует разведению крови в 50 — 1000 раз).
Для проведения анализа в зависимости от степени разведения достаточно 2-40 мкл 35 крови, или 1-20 мкл сыворотки или плазмы (в известном способе — 110 мкл). Это повышает чувствительность по сравнению с известным способом в 5— - 110 раз, При дальнейшем разведении снижается сигнал, 40 а следовательно, и точность измерения.
Разведение крови менее, чем в 50 раз нецелесообразно, так как требует большего объема крови, и, следовательно, приводит к снижению чувствительности способа. 45
AHC используется в способе в качестве тушителя собственной флуоресценции альбумина, Конечная концентрация АНС в анализируемой пробе 20 — 60 мкМ, оптимальная 50 концентрация — 40 мкМ.
B предлагаемом способе с целью стандартизации процедуры анализа используется раствор триптофана (10-50 мкМ).
Измерения интенсивности флуоресценции 55 в растворе триптофана для каждого конкретного прибора и измерительной кюветы достаточно провести один раз. Время ïðîведения одного анализа с момента получения разбавленной плазмы или сыворотки—
1-2 мин.
Пример 1. В 30 образцах плазмы по предлагаемому способу было определено соотношение альбумин/глобулин. С этой целью к 5 мкл плазмы каждого образца добавляют 1 мл буферного раствора следующего состава: трис-(оксиметил)-аминометан
10 мМ, ЭДТА 2 мМ, MaCt 145 мМ, рН 7,4, измеря ют инте нси в ность флуорес цен ции разбавленной плазмы до (Е) и после (Б) добавления 40 мкМ АНС. Измеряют интенсивность флуоресценции 40 мкМ раствора триптофана до (С) и после (Д) добавления 40 мкМ АНС. По формуле (1) и К = 3.13 рассчитывают значения АГК. Среднее значение в группе составило 1,40. Измерения проводят при следующих условиях: длина волны возбуждения 285 нм, длина волны флуоресценции 340 нм, расстояния между внутренними поверхностями прямоугольной кюветы 1 см;
Параллельно в этих образцах крови вычислены значения АГК с помощью известного способа среднее значение 1,41), Коэффициент корреляции между данными обоих способов составляет 0,92. При изменении концентрации АНС на 10 мкМ (25 /) и использовании постоянного коэффициента К=
2,13 определяемое значение АГК изменяется на 0,05 единиц (3 — 4%). Следовательно, небольшие вариации в концентрации АНС слабо повлияют на точность анализа, Коэффициент (К) в уравнении (1) зависит от концентрации АНС и при 40 мкМ равен 2,13.
Если ввести поправку на концентрацию, то точность способа будет еще выше.
Предлагаемый способ позволяет значительно упростить и ускорить определение
АГК. Проведение одного анализа (вместо двух в известном способе)с использованием одного флуоресцентного красителя (вместо набора реактивов ) приводит к упрощению способа, а сокращение времени инкубации красителя с образцом с 35 — 70 мин (s известном способе) до 0,5-1,0 мин (в предлагаемом способе) — к сокращению времени анализа до
1-2 мин. При этом происходит значительная экономия красителя — для проведения анализа требуется в 10 раз меньшее количество красителя, чем для определения альбумина по известному способу.
Кроме того, повышается чувствительность анализа по сравнению с известным способом в 5 — 110 раз за счет использования микроколичества крови (2-40 мкл), Положительные эффекты достигаются без уменьшения точности определения АГК.
Формула изобретения
Способ определения альбумин-глобулинового коэффициента крови, включающий
1720004
Составитель Н.Гуляева
Техред М.Моргентал
Корректор М.Максимишинец
Редактор И.Сегляник
Заказ 769 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ун.Гагарина, 101 получение плазмы или сыворотки крови, добавление к ней красителя с последующим анализом оптических свойств исследуемого и контрольного образцов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с цельюупрощения способа при одновременном повышении его чувствительности, в качестве красителя используют
N-фенил-1-амино-8 -сульфонафталин в концентрации 20-60 мкМ, измеряют интенсивность собственной флуоресценции в контрольном образце, содержащем триптофан, и в исследуемом образце, содержащем сыворотку или плазму до и после добавления красителя, .а альбумин-глобулиновый коэффициент рассчитывают по формуле
АГК =. К вЂ” 2, E ° л
Б С где АГК вЂ” альбумин-глобулиновый коэффициент;
Š— интенсивность собственной флуо5 ресценции плазмы или. сыворотки крови;
Б — интенсивность флуоресценции плазмы или сыворотки в присутствии красителя;
С вЂ” интенсивность флуоресценции кон10 трольного образца; содержащего триптофан;
Д вЂ” флуоресценция образца, содержащего триптофан в присутствии красителя:
15 К вЂ” числовой коэффициент, зависящий от концентрации красителя,
