Способ определения трипсина в дуоденальном содержимом

 

Использование: медицина, биохимическая диагностика хронического панкреатита . Сущность изобретения: готовят несколько проб с различным разведением, в качестве субстрата используют фибриноген с последующим добавлением тромбина. Концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился вибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем . 3 табл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s G 01 К 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K AB TOP CKOM Y CBNQETEflb CTB Y (21) 4819450/14 (22). 24.04.90 (46) l5.06.92; Бюл, N. 22 (71) Киевский институт усовершенствования врачей (72) И.И. Дегтярева, А.В. Гайсенко, Т,В. Варецкая, Т,М. Чернышенко, Н.А. Ироденко и

А,Д. Лысак (53) 615.475 (088.8) (56) Богер.,М,М. Методы исследования поджелудочной железы, Новосибирск: Наука, 1982, с. 90-92.

Изобретение относится к медицине. а именно к биохимической диагностике хронического панкреатита на основании о и ределения активности три псина в дуоденальном содержимом, Известен способ исследования трипсина в дуоденальном содержимом Бальцера и

Вернера, основанный на определении количества щелочи, нейтрализующей продукты, образующиеся при ферментативном расщеплении каэеина дуоденальн ым соком.

Однако титриметрическое определение количества щелочи связано с неточностями, что делает метод недостаточно воспроизводимым.

Известен также метод определения трипсина в дуоденальном содержимом по

Кунитцу в модификации M.Ï. Черникова. основанный на определении степени триптического гидролиза казеина по поглощению в ультрафиолетовом свете продуктов гидролиза, не осажденных ТХУ кислотой. Данная методика трудоемка, требует применения специального оборудования (сосудов для проведения энзиматической реакции спект.. Ж„„1741081 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИПСИНА

В ДУОДЕНАЛЬНОМ СОДЕРЖИМОМ, (57) Использование: медицина,. биохимическая диагностика хронического панкреатита. Сущность. изобретения: готовят несколько проб с различным разведением, . в качестве субстрата используют фибриноген с последующим добавлением тромбина.

Концентрацию трипсина определяют по . пробе, в которой впервые появился еибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем. 3 табл, рофотометра), недостаточно точна и воспроизводима. Активность трипсина при этом выражена в условных единицах, Известен способ определения трипсина в дуоденальном содержимом, основанный на расщеплении трипсином синтетического субстрата N-бензоил D-аргинин-пара-нитроанилина (БАПНА) в модификации B.À. Шатерникова, касающийся применения вместо трис-буфера вероналового буфера, Однако определение трипсина данным методом связано с грудностями, т.к; установление концентрации пара-нитроанилина в мутном дуоденальном содержимом часто невозможно. Рекомендуемая В.А. Illaтерниковым концентрация веронала близка к насыщенному раствору, в результате чего веронал легко выпадает в осадок, придавая мутность раствору, что также затрудняет фотометрию. Кроме того. фотометрия на двух волнах сопряжена с неточностями. Поэтому, несмотря на специфичность субстрата (БАПНА). воспроизводимость и точность метода определения трипсина недостаточ1741081 на. Недостатком является также и то, что активность фермента в этом методе выражается в условных единицах.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что в качестве субстрата-белка используют фибриноген с последующим добавлением тромбина, а концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился фибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем.

Способ осуществляют следующим образом, Реактивы: 1) 0,1 М фосфатный буфер рН

7,0; 2) фибриноген 100 мг растворить в 10 мл фосфатного буфера рН 7,0 при 37 С, добавляя по частям растворитель; 3) соевый ингибитор трипсина 8,5 мг растворить в 5 мл

0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, в 2 раза разбавленного 0,15 М раствором NaCI; 4) тромбин 10 мг растворить в 2 мл 0.15 М

NaCl, отцентрифугировать и разбавить еще в 5 раз 0,15 М NaCl; 5) дуоденальное содержимое отцентрифугировать и разбавить базальный секрет в 20 раз и брать в тест в количестве от 0,05 до 0,025 мл, стимулированный секрет — в 50 раз и брать в тест в количестве от 0,1 до 0,025 мл.

Оборудование: водяная баня. . Постановка теста. В 8 пробирок вносят по 0,5 мл раствора фибриногена и разведенное базальное дуоденальное содержимое в количестве 0,05; 0,04; 0.03 и 0.025 мл; стимулированное дуоденальное содержимое в количестве 0,1; 0,075; 0,05 и 0,025 мл, Затем пробирки ставят в водяную баню при 37 С на 15 мин, после чего вносят по 0.1 мл соевого ингибитора трипсина, держат на холоде в течение 10 мин и добавляют по 0,1 мл раствора тромбина, помещают на 30 мин в водяную баню при 37 С. После этого осуществляют визуальное наблюдение, В опытах с модельными системами (вместо дуоденального содержимого вносились различные количества кристаллического трипсина) установлено, что критическая концентрация трипсина, при которой выпадает мельчайшая фибриновая муть, составляет 0,8 мкг/мл. Таким образом, учитывая разведение дуоденал ьного содержимого. можно рассчитать концентрацию трипсина.

Например, базальный секрет был разбавлен в 20 раз, В тест взяты следующие количества: 0,05; 0,04; 0,03 и 0,025 мл.. При 0.03 мл появилась фибриновая муть, что соответствует 0 8 мкг, В 0,03 мл исходного дуоденального содержимого содержится 0,8 20 =

=16 мкг, а в 1 мл 533 мкг, Следовательно, концентрация трипсина в исследуемом дуоденальном содержимом составляет 533 мкг/мл.

Пример 1. Больная П„диагноз: хронический панкреатит, хронический гаст5 родуоденит, Активность трипсина в базальной порции дуоденального содержимого составила 400 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 20 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,04

10 мл разведенного дуоденального содержимого). Активность трипсина в стимулированном секретином и панкреозимином секрете (дуоденальное содержимое разведено в 50 раз, выпадение фибриновой мути произош15 ло при внесении 0,05 мл разведенного дуоденального содержимого) составила 800 мкг/мл.

Пример 2. Больной М„диагноз; хронический холецистит, хронический гаст20 родуоденит. Активность трипсина в базальной порции дуоденального содержимого составила 533 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 20 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,03

25 мл дуоденального содержимого). Активность трипсина в стимулированном секретином и панкреозимином секрете (1 кд/кг массы тела внутривенно струйно) составила

1600 мкг/мл (дуоденальное содержимое

30 разведено в 50 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,025 мл разведенного дуоденал ьного содержимого), По, предлагаемому способу проведено

100 исследований активности трипсина в

35 дуоденальном содержимом. Приводятся данные, характеризующие воспроизводимость полученных результатов .предлагаемым методом и прототипом. .Воспроизводимость результатов оцени40 вали с помощью коэффициента вариации: и

V= — 100 j; х=

S - x, х и

45 где х — результат отдельного определения; х — средняя арифметическая:

50 n — число определения;

S — среднеквадратическое отклонение, При исследовании образца дуоденального содержимого предложенным методом определена активность трипсина, мкг/мл;

55 При исследовании образца дуоденального содержимого методом прототипа пол учены результаты, представленные в табл.2.

Таким образом, из приведенных данных видно, что точность (воспроизводимость) 1741081

Таблица 1

5 с

Показатели

10 х. х-.х

-г х-х

1000

4900

900

900

800 30

900

900

900

1000 70

4900

900

900

800 . 30

900

Продолжение табл, 1

Таблица 2

Показатели

306

16

256

308

16

256

0 ,0

311

81

900. 314

318

292

28

784

344

24

576

370

2500 х х-х х-х г

Продолжение табл. 2 мед/мл; S = 28,6; V = 8, предлагаемого метода выше, чем прототипа.

Статическим критерием правильности является степень отклонения средней арифметической от должного значения. Для определения правильности предлагаемого метода использован способ добавки — внесения в биологическую жидкость точно взвешенного количества анализируемого вещества и определения его с помощью исследуемого метода. Для этого в пробирку внесено 10 мг кристаллического трипсина, добавлено 10 мл 0,15 М NaCI. При этом получен раствор трипсина концентрации

1000 мкг/мл. Результаты определения активности трипсина в данной пробе предлагаемым методом представлены в табл.3, Процент отклонения от заданной величизадин. вуич. — ктич, вел. (зурн. вел ич,)

1000 -960 — 100 % =4%. Таким образом, отклонение от заданной величины составляет всего 4%.

Предлагаемый способ определения трипсина в дуоденальном.содержимом по5 зволяет получать результаты с достаточной воспраизводимостью. Способ достаточно прост, доступен, может быть широко использован в профильных учреждениях и не требует применения дефицитных реакти10 вов, специальной аппаратуры.

Формула изобретения

Способ определения трипсина в дуоденальном содержимом путем взятия пробы, ее разведения, инкубации с субстратом и

15 оценки результатов, отличающийся тем, что. с целью повышения точности способа готовят несколько проб с различным разведением, в качестве субстрата используют фибриноген с последующим дабавле20. нием тромбина, а концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился фибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем, 1741081

Таблица 3

Продолжение табл. 3.

Составитель Н.Теренина

Техред M,Ìoðãåíòàë Корректор А.Ротман

Редактор M,Öèòêèíà

Заказ 2083 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Показатели х х-х «-2 х-х

1000

1600

1000

1600

1600

25300

25300

1000

1600

1000

1600

800 1000

160 40

25300 1600

1000

1600