Рекомбинантная плазмидная днк @ blv 51-3, кодирующая кор- антиген вируса гепатита в с экспонированным на его поверхности эпитопом blv @ 51 (56-103), вируса лейкоза крупного рогатого скота способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент кор-антигена вируса гепатита в с экспонированным на его поверхности эпитопом blv @ 51 (56-103)

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии и биотехнологии . Целью изобретения является получение рекомбинантных капсидных структур, представляющих собой кор-антиген вируса гепатита В, 39 С-аминокислот которого заменены на последовательность BLV gp 51

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

IM (гЭ.

6д

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4728252/13 (22) 10.08.89 (46) 23.06.92. Бюл. М 23 (71) Институт органического синтеза АН

ЛатвССР (SU), Отдел медицины (Шарите)

Университета Гумбольдта (Берлин) (00) (72) Райнер Ульрих, Хельга Сиаккоу, Корнелия Платцер, Зинаида Розенталь, Ханс Альфред Розенталь, (DD), Г.П. Борисова, И.Г.

Берзинь, Д.Э. Дрейлиня, В.Я. Лосева, Ю.А.

Озолс, В.П. Осе, П.М. Пушко, В.В. Цибиногин, П.П, Пумпен и Э.Я. Грен (SU), (53) 575.224.2.577.2(088.8) (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК р BLV51-3, КОДИРУЮЩАЯ КОР-АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В С ЭКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО ПОВЕРХНОСТИ

ЭПИТОПОМ BLVgp 51 (56 — 103) ВИРУСА

ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СПОСОБ. ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И

ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕИ1СН1А COLLПРОДУЦЕНТ КОР-АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В С ЭКСПОНИРОВАННЫМ HA

ЕГО ПОВЕРХНОСТИ ЭПИТОПОМ BLVgp 51 (56-103). (57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии и биотехно-. логии. Целью изобретения является получеИзобретение относится к микробиологической и.медицинской промышленности. генной и белковой инженерии, биотехнологии.

Целью изобретения является получение рекомбинантных капсидных структур, представляющих собой кор-антиген вируса гепатита В, 39 С-концевых аминокислот которого заменены на последовательность,, Б2,, 1742331 А1 (я)з С 12 N 15/48, 15/51, 1/21 ние рекомбинантных капсидных структур, представляющих собой кор-антиген вируса гепатита В, 39 С-аминокислот ко .oporo заменены на последовательность BLV gp 51 (56 — 103) — белка вируса лейкоза крупного рогатого скота. Плазмида pBLV 51-3 размером 7047 п,о. экспрессирует ген НВсАдЬ—

BLVgp 51 (56 — 103), кодирующий синтез рекомбинантных капсидных структур

HBcAg Ь вЂ” BLVgp5, обладающих антигенностью и иммуногенностью HBcAg — вируса гепатита В и белка gp 51 — вируса лейкоза крупного рогатого скота. Плазмида не коньюгативна. Уникальные сайты, рестрикции плазмиды; BamHI, Sphl, Sall, Nrul, SnaL

АзlШ, Pst!, Sca1, ХЬа1, Ncol. Ген НВсАдЬ—

BLVgp — 51 находится под контролем тандема промоторов Ptrp. Способ конструирования заключается во встраивании Bgl 11Bam Hl фрагмента плазмидной ДН К рНМ193/4 в плазмидную ДНК рНВ с 1615 по сайту

ECoRV, что приводит к терминации трансляции, исключающей 39 С-концевых аминокислот гена НВс Ад. Штамм Escherichla coll

В КПМ В-4969 — продуцент рекомбинантных капсидных структур НВс АдЬ вЂ” BLVgp 51 (56-103), обеспечивает выход целевого и родукта в количестве 26;7 5 суммарного белка

3 табл.

BLV gp 51(56 — 103) — белка вируса крупного рогатого скота.

Сконструирован рекомбинантный ген

Н BcAg Ь вЂ” 8LV gp 51 (56- 103), кодирующий синтез соответствующего белка и плазмиды. рВ1Ч 51-3 для его экспрессии, а также штамм — продуцент Е. coll (pBLV 53 — 3) рекомбинантной структуры HBcAgh — BLV

gp 51(56 — 103), обеспечивающий выход ко1742331 нечного продукта в количестве не менее

26,7% от суммарного белка Е, coll, Рекомбинантная плазмида "pBLV 51-3 состоит из следующих элементов: ДНК плазмиды рВс1615, которая представляет собой вариант плазмиды рНВсЗ, содержащей ген HBcAg с оптимизированным участком инициации трансляции, но с мутантным геном HBcAg, содержащим полилинкерную

10 вставку по 144-й аминокислоте и предназначенным для внедрения чужеродных последовательностей по этому участку, протяженность 6900 п.о„ фрагмента генома

В LV, соответствующего последовател ьности между сайтами рестрикции Bgl !.!оввз и 15

Bam Н 1юы и кодирующего участок др 51(56103) протяженностью 143 п.о.

Размер плазмиды 7000 п.о., мол. м. 4,49

МД. В состав ДНК рекомбинантной плазминого продукта, и ген В!э, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген HBcAg А — BLVgp 51(56-103) находится под контролем тандема промоторов

Ptrp, Плазмида pBLV 51-3. амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола, неконьюгативнэ.

Сущность способа конструирования плазмиды pBLV51-3 состоит в том, что фрагмент гена епч BLV, именуемый BLVgp 51(56 — 103), протяженностью 143 п-.о., внедряют по сайту рестрикции EcoRV в векторную плазмиду рН Вс 1615 с образованием рекомбинантного гена Н BcAgA — gp 51 (56 — 103).

В результате делеции в векторной плазмидной ДНК утрачивается С-концевая часть гена Н BCAg, терминация же рекомбинантного

40 гена наступает непосредственно за внедренным фрагментом BLV gp 51(56 — 103).

Штамм — продуцент Н ВсА9Л вЂ” BLVgp

51(56 — 103) получают трансформацией клеток Е. coll К80? рекомбинантной плазмидной ДНК pBLV 51-3.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидной формы, грам-отрицательные.

Культурэльные признаки, Клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины.

Физико-биохимические признаки.

Оптимальная температура культивирования 37 С, оптимум рН 7,0 — 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота — минеральные соли, а также оргайические соединения в виде пептона, триптона, аминокислот. ды pB LV 51-3 входят ген H BcAg Л вЂ” ВЫцр. 20

51(56-103), обеспечивающий синтез конечУстойчивость к антибиотикам.

Устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивосчти к ампициллину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК экспресс-методом.

Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4969.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBLV 51-3.

2 мкг плазмиды рНВс1615, выделенной стандартным методом, расщепляют частично 2 е, рестриктазы Е. coRV в 25 мкл раствора А, содержащего 10 мМ трис-HCI, pH

7,5; 50 мМ NaCI и 10 MM MgClz, в течение 0.5 ч при 37 С. Рестриктазу инактивируют 15минутным прогреванием при 65 С. Линейную плазмидную ДНК протяженностью

6900 п.о. выделяют из 0,7%-ного агарозного геля и растворяют в 20 мкл Н20 (ДН К 1).

20 мкг плазмиды рНМ 19-3/4 расщепляют 50 ед, Bgl II и 50 ед. Bam HI в 100 мкл раствора А в течение 2 ч при 37 С, -наносят инкубационную смесь на 1,5-й агарозный гель, фрагмент с мол. м. 91 КД (размером 143 п,о,), несущий эпитоп BLVgp 51(56 — 103), выделяют из агарозного геля известным методом, Фрагмент растворяют в 10 мкл .HzO, липкие концы заполняют в 20 мкл раствора

Б, содержащего 50 MM трис-НО, рН 7,5, 10 мМ MgClz, 10мМ дитиотрейтол, 25мМ NaCI, 100 pM dATP, dCTP, dTTP u dGTP и 5 ед.

ДН К-полимеразы Е. соП (фрагмент Кленова); в течение 1 ч при 12ОС (ДНК2).

0,25 мкг ДНК 1 и 0,1 мкг ДНК 2 зашивают Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора В, содеражщего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ

MgCI2 l0 мМ дитиотрейтол. 50pM ATP и 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение.12 ч при 37 С, Фермент инактивируют нагреванием при

65ОС в течение 15 мин. К реакционной сме и добавляют 100 мкл клеток Е, coll RR1, обработанных 100 мМ CaCI2 (конечная концент-, рация 5 х 10 кл./мл), для трансформации

9 клеток по известному методу.

Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной экспресс-методом. Плазмида с ожидаемой рекстрикционной картой получает наименование pBLV 51-3.

Il р и м е р 2, Штамм-продуцент Е. соИ

К802 (pBLV 51-3). Выделение и очистка рекомбинантного белка HBcAg Л вЂ” BLVgp

51(56 — 103).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е. coll К802 рекомбинантной.1 742331 плазмидой pBLV 51-3. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казаминовые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин

0,02, до оптической плотности ОПТ 4 — 5.

Клетки собирают центрифугированием и ли- 5 зируют в четырехкратном объеме буфера, содержащего 0,05 М трис-НО, рН 8.0, 0,15

M NaCI, 0,1% тритон Х100, 0,005 M ЭДТА, 2 мг/мл лизоцима. После инкубации в течение 30мин при 4ОС клетки подвергаютдвух- 10 кратному замораживанию. — оттаиванию, добавляют дезоксирибонуклеазу и Mg Clz до конечной концентрации 20 мкг/ мл (10 мМ) и инкубируют 30 мин при 4 С. Лизат осветляют центрифугированием (10 000 х g, 4ОС). 15

Н В сАцЛ вЂ” BLVgp 51(56 — 103) очищают следующим образом.

Бесклеточный лизат разбавляют в 4 раза дистиллированной водой и подвергают ф ра кциони рован и ю сульфатом аммония. 20

l BcAg Л вЂ” ВО/др 51(56 — 103) собирают в осадке, полученном при 30% насыщения сульфатом аммония. Осадок растворяют в

0,05 M трис-НС1, рН 8,0, 0.15 M NaCI, 0,1% тритоне Х-100 до конечной концентрации -25 белка 25 —.50 мг/мл, и 2 — 4 мл этого раствора наносят на колонку с сефарозой(1,6 х.100 см), уравновешенную тем же буфером, но без тритона Х-100. Фракции, проявляющие

HBcAg-активность, собирают и используют 30 либо непосредственно, либо после концентрирования переосаждением 50%-ным .. сульфатом аммония.

Il р и м е р 3. Определение НВсАЯ-активности методом РИД. 35

Титр HBcAg определяют с помощью радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони.

Для этого готовят двухкратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против анти-НВс антител человека. В. каче- 40 стве стандарта используют очищенный HB

cAg, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл). Результаты титрования HBcAg-активности методом РИД приведены в табл. 1. 45

ll р и м е р 4. Определение gp 51.-активности методом иммуноблотинга, Мол. м. белка H BcAgh — BLVgp 51(56 — 103).

Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения 50 образцов на полиакриламидный гель по

Лэммли, содержащего 2-%-ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2%-ный Р-меркап тоэтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные ли- 55 заты (2 — 4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12 — 18%). размером 150 х 150 х 0,75 мм. Электрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока 7 мА..

После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу. Фильтры инкубируют с моноклональными анти-gp 51 антителами

mAK14 в разведении 1:500 на буфере TBS c

1% БСА в течение 15 ч при 20 С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при комнатной температуре с конь югатом: пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:200. Фильтры отмывают буфером TB$ (3 — 5 раз) и проявляют диаминобензидином. Лизаты клеток штамма— продуцента обнаруживает при этом появление специфических зон окраски, соответствующих белку с мол. м, 21,2 КД (или длиной 200 аминокислот). Контрольные лизаты клеток Е. coll К802(рНВсЗ) таких зон не обнаруживают.

Пример 5, Электронно-микроскопическая характеристика рекомбинантных капсидных структур Н ВсАдЛ вЂ” BLVgp 51(56 — 103).

Препараты очищенного белка HBcAg Л вЂ” BLVgp 51(56 — 103) готовят методом негативного контрастирования с применением

1%-ного уранилацетата и исследуют на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кB и инструментальном увеличении 100000 раз, Белок HBcAg Л—

BLVgp 51(56 — 103) образует капсиды с диаметром 25 нм, Пример 6. Определение gp 51-активности в составе капсидных структур

HBcAgh, — BLVgp 51(56 — 103) методом энзимоиммунологического анализа на твердой фазе.

8 качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. Очищенный белок Н ВсАдЛ вЂ” 8LVgp 51(56 — 103) разводят до определенной концентрации (мкгlмл) в

50 мМ трис- fCI, pH 8.0, 0,15 M NaCI и вносят в лунки планшетов — по 100 мкл в каждую.

Инкубируют 1 ч при 37 С, после чего раствор удаляют из лунок, планшеты отмывают

4.— 5 раэ дистиллированной водой и высушивают. В лунки вносят моноклональные антиgp 51 антитела мыши (МАК 14) в различных разведениях. После инкубации в течение 1 ч при 37 С планшеты отмЫвают дистиллированной водой и вносят по 100 мкл коньюгата пероксидазы хрена с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1;500.

После инкубации в течение- 1 ч планшеты отмывают и проводят цьетйую реакцию. В лунки вносят по 100 мкл 0,25%-ного раствора ортофенилендиамина, 2% НС! в 0,1 М цитрате натрия, рН 5,0, 0,02% Hz0z, инкубируют 30 мин при 20 С, реакцию останавли1742331 вают добавлением 100 мкл 0,1 н. НО. Появление коричневой окраски свидетельствует о наличии gp 51-активности, для количественной оценки активности измеряют оптическую плотность при 492 нм (табл. 2).

Отсутствие реакции в отрицательном конт. ропе (HBcAg) свидетельствует о специфичности связывания анти-gp 51 антител рекомбинантными капсидными структурами HBcAg Л вЂ” BLVgp 51 (56 — 103).

Пример 7, Определение gp51-активности на поверхности капсидных структур

HBcAg Л- BLVgp 51(56 — 103) методом иммуноэлектронной микроскопии.

Капсиды НВсА9Л вЂ” BLVgp 51(56 — 103) . сорбируют на никелевой сеточке, покрытой формваровой пленкой, в течение 15 мин.

Сеточку промывают 0,5 мл раствора PBS, содержащего 0,05 Твин-20 (PBS-Твин-20) и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1%-ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл

PBS-Твин-20, инкубируют 15 мин,в 0,03 мл раствора моноклональных анти-gp 51 антител человека МАК14 в разведении 1:100, промывают 0,5 мл PBS-Твин-20, инкубируют 20 мин в 0,03 мл антител (кролика) против иммуноглобулинов мыши (в разведении

1:500) и промывают 0,5 мл PBS-Твин-20. Се-. .точку помещают на 1 ч в 0,03 мл раствора рА-Аи, содержащего белок А, который коньюгирован с частицами коллоидного золота диаметром 5 нм, промывают 0 5 мл PBSТвин-20 и затем 1 мл НгО. Капсиды окрашивают методом негативного констатирования 0,15 мл 2%-ного уранилацетата. Все операции выполняют при 20 С.

В случае поверхностной локализации соответствующих эпитонов капсиды на электронной микрофографии окружены венчиком . частиц коллоидного золота. В качестве отрицательного контроля используют капсиды НВсА9Л, не несущие эпитоп gp 51(56—

103). Эти капсиды не образуют комплексонов с коллоидным золотом. Не образуются комплексы также в отсутствие специфиче-. ских антител, Пример 8. Иммуногенная активность рекомбинантных капсид HBcAg Ь вЂ” BLVgp

51(56 — 103), Для определения иммуногенности рекомбинантными капсидами НВсАцЛ

BLVgp 51(56-103) иммунизируют кроликов.

Для этого смешивают 2 мг антигена; растворенного в 1 мл физиологического раствора

PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда

5 f0 и получают гомогенную эмульсию. Антиген вводят подкожно. Инъекции антигена повторяют на 14-й и 21-й день и.с 28-го дня начинают брать кровь. Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух антигенов: HBcAg (для. определения анти-НВс антител)= fr-BLVgp

51 (для определения анти-gp 51 антител).

Титры антител на 28-ный день иммунизации приведены в табл. 3, Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pBLV 51-3, кодирующая. кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности эпитопом 8LVgp 51(56 — 103) вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 7047 п.о. и мол. м. 4,5 МД, содержащая плаэмидную ДНК рНВс l615 размером 6900 п.о., обработанную рестриктазой

20 Е coR V; -Bgl Пвовз = Bam Н1вггв — фрагмент плазмидной ДН К р Н М 19-3/4 размером 147 п.о„кодирующий участок белка gp 51(56

103) вируса лейкоза крупного рогатого скота, обработанный ДНК полимеразой Е, coll, 25 уникальные сайты рестрикции и их координаты: Bam Н1 (0), Sph 1(101), Sal 1{276), Nru

1(599), Sng 1(1871); Af ill I (2098); Pst l 1(3236), Scg 1(3471) ХЬа 1(5176), Nco 1(5569); гены, генетические маркеры и регуляторные уча-

30 стки:-ген HBcAg Л вЂ” BLVgp 51(56 — 103), обеспечивающий синтез рекомбинантных. капсидных структур — НBcAgh, — ВLgp 51(56 — 103) (координаты 5087 — 5670: ген Bla, обеспечивающий устойчивость к ампицил35 лину (координаты 2918 — 3778); ген HBcAg

Л вЂ” В 9р51 находится под контролем тандема промотора Ptrp.

2. Способ конструирования рекомбинантной плаэмидной ДНК, кодирующей

40 кор-антиген вируса гепатита В, экспонированной на его поверхности эпитопом BLVgp

51 (56 — 103) вируса лейкоза крупного рогатого скота, pBLV 51-3. предусматривающий получение фрагмента генома BLV длиной

45 143 п.о., кодирующего участок gp 51(56—

103), клонирование его в Е coRV-сайт плазмиды рН Вс 1615, при этом 39 С-концевых аминокислот удаляют в результате делеции, трансформацию рекомбинантными ДН К

50 клеток Е. coll и отбор клонов. содержащих плазмидную ДНК.

3. Штамм бактерий Езспег!сЬа coll

BKKM В-4969 — продуцент кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его

55 поверхности) эпитопом BLVgp 51(56 — 103) вируса лейкоза крупного рогатого скота.

1742331

Таблица1

Штамм

НВСА9 мг/мл

Белок,мг/мл

Титр в РИД

ОПт о

26,7

1:256

4,0

4.0

15,0

Таблица2

Анти - gp 51 (mA К 14) Имм нологическая активность, ОП4д2/мл

Сорбированный антиген

Анти-НВс С1-3

0,670

0,722

0,535

0,016

Таблица3

Редактор И.Дербак

Заказ 2262 Тираж Подписное

ВН ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Е.соИ К802

BLV 51-3

Н ВсАцЛ- 51 (56-103).

НВсА конт оль

Выход прокта, Составитель С,Бандрин

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор О.Кравцова