Фрагмент днк, кодирующий гормон роста овцы, рекомбинантная плазмидная днк роgнтrр11, кодирующая синтез гормона роста овцы, штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент гормона роста овцы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии. Цель изобретения - создание штамма-продуцента гормона роста овцы. Сконструированы ген, кодирующий зрелый гормон роста овцы, рекомбинантная плазмидная ДНК, pOGHtrp 11. содержащая данный ген под контролем промотора trp-оперона Е. coil. Получен штамм, трансформация которого плазмидной pOGHtrp 11 приводит к эффективному и стабильному синтезу гормона роста овцы. 3 „. с.п.ф-лы, 8 ил., 2 табл.5 со С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/18, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4800417/13 (22) 20.11.89 (46) 30.04.92. Бюл. М 16 (71) Институт молекулярной биологии им.

В.А,Энгельгардта и Целиноградский сельскохозяйственный институт (72) П.М.Рубцов, С.Т.Садиев, B,Ã.Ãîðáóëåâ.

А.А.Шульга, К.А.Сагадиев, К.Г.Скрябин и

А.А.Бае.в (53) 575,224.2.577.2/048 (088,8) (56) EllB, 0125818. кл. C 12 N 15/00, 1984. (54) ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ГОРМОН РОСТА ОВЦЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ

ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pOGHtrp 11, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ГОРМОНА РОСТА ОВИзобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии. Предлагаются ген, кодирующий гормон роста (ГР) овцы, рекомбинантная плазмида, содержащая этот ген, и штамм бактерий — продуцент ГР овцы.

ГР животных — полипептидные гормоны, состоящие из одной цепи длиной около

190 остатков. Особенностью ГР является видовая специфичность. Указанные соединения представляют интерес для животноводства, поскольку они необходимы для . сбалансированного роста молодых живо; тных. Их действие приводит к увеличению транспорта аминокислот в клетки, стимуляции синтеза белка на рибосомах, увеличению митотической активности клеток.

Введение ГР вызывает увеличение веса животных, в связи с этим они рассматриваются

„„5LI „„173О150 А1

ЦЫ, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERlCHIA

COLL — ПРОДУЦЕНТ ГОРМОНА РОСТА ОВЦЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии. Цель изобретения — создание штамма-продуцента гормона роста овцы. Сконструированы ген, кодирующий зрелый гормон роста овцы, рекомбинантная плазмидная ДНК, pOGHtrp

11, содержащая данный ген под контролем промотора trp-оперона E. coll. Получен штамм, трансформация которого плазмидной pOG Htrp 11 приводит к эффективному и стабильному синтезу гормона роста овцы. 3 с.п.ф-лы, 8 ил., 2 табл. в качестве препаратов, перспективных для повышения продуктивности животноводства.

Существующие методы выделения ГР из гипофизов животных не позволяют получать их в достаточных количествах. Альтернативным подходом является синтез ГР в клетках микроорганизмов на основе методов генетической инженерии. Известны клонированный ген (кДНК) предшественника ГР овцы и плазмида. несущая этот ген, однако нет каких-либо сведений о получении штамма-продуцета ГР овцы.

ГР овцы отличается от ГР крупного рогатого скота (КРС)заменой глицина на валин в положении 129 аминокислотной последовательности. При использовании ГР КРС в качестве стимулятора роста в овцеводстве нельзя исключить возможности выработки нейтрализующих антител при длительном

1730150

40

55 введении препарата, что приведет к снижению его эффективности. Для применения в овцеводстве предпочтительным представляется препарат ГР овцы. Этим определяется практическое значение ГР овцы, Целью изобретения является создание штамма — продуцента ГР овцы.

Для достижения поставленной цели сконструированы ген, кодирующий зрелый

ГР овцы, рекомбинантная плазмидная ДНК, poGHtrp11, содержащая данный ген под контролем промотора trp-оперона Е. coli, и подобран штамм-реципиент, трансформация которого плазмидой poGHtrp11 приводит к эффективному и стабильному синтезу

ГР овцы, На фиг. 1 изображена нуклеотидная последовательность EcoRI-Hindill-фрагмента, кодирующего ГР овцы, и аминокислотная последовательность целевого продукта (подчеркнут участок расщепления рестриктазы Aatil, введенный с помощью мутагенеза); на фиг. 2 — схема рекомбинантной плазмидной ДНК pOGHtrp11, amp, tet-гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, P«ð-промотор триптофанового оперона, OGH-фрагмент, кодирующий гормон роста овцы, IS3 — фрагмент iS3-элемента (сайты рестрикции обозначены Š— EcoRI, EV—

EcoRV,  — BamHI, Н вЂ” Hindlll, HP — Hpal, Р—

Pstl, S — SalGl, SM — Smal, Аа — Aatll); на фиг.

3 — нуклеотидная последовательность фрагмента 153-элемента; на фиг. 4 — схема конструирования плазмиды pBGHBal12 (сайты рестрикции обозначены; А — Apal, Pv — Рно И, остальные обозначения, как на фиг, 2; на фиг. 4А — схема конструирования плазмиды

syn/pBR327; на фиг. 4Б — схема конструирования плазмиды pBGH1-190; на фиг, 4В— схема конструирования плазмиды

pBGHBal12; на фиг. 5 — структура синтетических олигонуклеотидов, использованных для сборки фрагмента, кодирующего N-концевую часть гормона роста крупйого рогатого скота; на фиг, 6 — схема конструирования рекомбинантного бактериофага mp8/bGH; на фиг. 7- схема конструирования рекомбинантного бактериофага mp8/oGH; на фиг. 8— схема конструирования рекомбинантной плазмиды pOGHtrp11.

Фрагмент ДНК. кодирующий ГР овцы, имеет длину 601 п.о., получен путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза фрагмента кДНК ГР крупного рогатого скота (КРС) и имеет последовательность нуклеотидов, представленную на фиг. 1.

Сущность рекомбинантной плазмиды

poGHtpr11 (фиг. 2) состоит в том, что она содержит репликон и гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину плазмиды

pBR322, промотор trp-оперона Е; coli, фрагмент, кодирующий ГР овцы, и фрагмент!33элемента бактерий, а именно состоит из следующих элементов:

EcoR I-Hindi l I-фрагмента плазмиды

pSTH2191 размером 5300 п.о., включающего участок начала репликации, гены устойчивости к ампициллину (Ыа) и тетрациклину (tet) и промотор trp-оперона Е. cali;

EcoR I-Hindi I l-фрагмента, кодирующего

ГР овцы, размером 601 п.о., полученного с помощью мутагенеза фрагмента ДНК, кодирующего ГР КРС;

Hindi l I-фрагмента I S3-элемента размером 916 п.о,.

Размер плазмиды pOGHtrp11 составляет 6819 п.о. Копийность плазмиды около 20 молекул на клетку, ДНК плазмиды pOGHtpr11 содержит уникальные сайты рестрикции EcoRI, Hpal.

Smal, BamHI, SaiGI, EcoRV,2 сайта рестрикции Hindlll и 3 сайта рестрикции Pstl, Положения всех перечисленных сайтов рестрикции относительно уникального

EcoRI-сайта показаны в табл. 1.

Синтез ГР овцы осуществляется под контролем trp-промотора. Наличие в плазмиде фрагмента! ЯЗ-элемента стабилизирует синтез целевого продукта.

Полная первичная структура всех элементов, из которых построена плазмида

pOGHtrp11, известна, Первичные структуры фрагмента, кодирующего ГР овцы, и фрагмента IS3-элемента представлены на фиг. 1 и 3 соответственно.

Штамм-продуцентр ГР овцы получен трансформацией клеток Е. соИ ОН1 плазмидной pOGHtrp11. Уровень синтеза ГР по данным. иммуноферментного анализа составляет 50 — 60 мкг на 1 мл ночной культуры.

Штамм депонирован- во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН

СССР под номером ВКМ CR-326Д. Штамм Е. соП 0Н1, содержащий плазмиду pOGHtrp11, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. При росте на питательном агане "Дифко" колонии гладкие, круглые, блестящие, серые. Края колоний ровные.

При росте в жидких средах YT,LВ,М9 образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования

37 С, оптимум рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, 1730150

6 спирты, органические кислоты. В качестве из геля стандартным методом. ДНК после источника азота используют как минераль- переосаждения спиртом растворяли в 20 ные соли в аммонийной или нитратной фор- мкл воды. ме, так и органические соединения —. 5мкгплазмиды pBR327(SobегоnX.etal. пептон, триптон. аминокислоты. 5 Gene, 1980,9,287) гидролизовали рестриктаУстойчивость к антибиотикам; проявля-, зами EcoRI u Hindlll в инкубированной смеют устойчивость к ампициллину, обуслов- си следующего состава: 50 вМ трисНС!. рН ленную наличием плазмиды. Проявляют 7;5, 100 mM NaCI, 10 mM MgCIz, 1 вМ ДТТ, устойчивость к тетрациклину при концент- 10 ед. EcoRI и10ед, Hindlll в течение 2 ч при рации последнего не более 5-.7 мг/л. 10 37 С. Смесь фракционировали в 1% агароэПример 1. Конструирование реком- ном геле и элюировали линейную форму бинантной.плазмидной ДНК pBGHBa112.. плазмиды, используя легкоплавкую агарозу

Схема конструирования плазмиды фирмы BRL. ДНК переосаждали спиртом и

pBGHBa12 представлена на фиг. 4 (А — В). растворяли в 50 мкл воды, А) Конструирование плаэмиды 15 Лигирование фрагмента ДНК и плазмиsyn/pBR327 (фиг. 4А), ды проводили в смеси объемом 20 мкл, со Для получения фрагмента ДНК, кодиру- держащей 1 мкл раствора фрагмента, 1 мкл ющего N-концевую часть ГР КРС(аминокис- раствора плазмиды, 20 mM трисНС!, рН лоты 1 — 23), использовали синтетические. 7,5, 10 mM ДТТ, 10 mM М9О2, 1 mM ATP, 5 олигонуклеотиды, структура которых пред- 20 ед. ДНК-лигазы фага Т4..при 4ОC в течение ставлена на фиг. 5. Структура олигонуклео- 12 ч, К 2 мкл инкубационной смеси добавлятидов выбрана с таким расчетом, чтобы.. ли48мкл TE-буфера(50тМтрисНС!,рН8,0, синтетические фрагмент ДНК имел липкие 1 mM ЭДТА). Раствором ДНК трансформиконцы для рестриктаэ EcoRI u Hindlll. Ини-, ровали клетки штамма Е. coli HB101, исциирующий ATG-кодон расположен перед 25 пользуя стандартную методику. Отбирали кодоном1-й аминокислоты зрелого ГР КРС-. клоны с фенотипом Ар Тс . Наличие . фенилаланина, B участке, соответствующем вставки с нужной ориентацией проверя22 23 кодонам Glu .-Leu, предусмотрен сайт ре- ли секвенированием по методу Максамастриктазы Pvull, позволяющий сшить синте- Гилберта. В результате была отобрана тический фрагмент ДНК с фрагментом, 30 плазмида, обозначенная syn/pBR327. кодирующим остальную часть молекулы ГР . Б) Конструирование плазмиды.pBGH1.(остатки 24-190). 190 (фиг. 4Б).

Фосфорилирование и сшивку олигонук- 10 мкг ДНК плазмиды pbGH18 гидролилеотидов проводили следующим образом. зовали в инкубационной смеси объемом 50

5 мкг каждого из 10 олигонуклеотидов 35 мкл 30 ед. рестриктазы Есой! в течение 1,5 инкубировали при 37 С 15 мин в 20 мкл чпри37 С,какописаноранее;ДНКизсмеси инкубационной смеси, содержащей 50 mM осаждали спиртом, высушивали и растворятрисНС!, рН 7,5, 5 mM MgCb. 5 mM дитиот- ли в воде. Гидролиз линеаризованной плазрейтола (ДТТ), 5 mkCI y — P — ATP (800 миды pbGH18 рестриктазой Pvull

Ci/mmol), 4 ед. полинуклеотидкинаэы фага 40 проводили в 100 мкл инкубационной смеси

Т4. Затем добавляли 1 мкл 10 mM.ðañòâoðà в среднесолевом буфере в течение 10 мин немеченного AEP и инкубировали еще 30 при 37 С. На 10 мкг ДНК брали 30 ед. феро мин при 37 С. Эффективность фосфорили- мента. Реакцию останавливали добавленирования проверяли с помощью электрофо- ем раствора ЭДТА до концентрации 20 mM. реза .1 мкл каждой инкубационной смеси в 45 Реакционную смесь экстрагировали рав20% денатурирующем полиакриламидном ным объемом смеси фенол — хлороформ. геле с последующей авторадиографией. Ин- ДНК из водной фазы осаждали спиртом, выкубационные смеси объединяли, добавляли сушивали, растворяли в воде и фракциони50 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубировали ровали в 1% агарозном геле. Нужный втечение12ч при 4 С. Смесь прогревали 10 50 фрагмент ДНК (Pvull-EcoRI-фрагмент разо мин при 70 С, добавляли 5 M раствора NaCI ... мером 680 п.о.) элюировалиизлегкоплавкой до концентрации 100 mM. 50 ед. рестрикта-, . агарозы с помощью стандартной процеду; зы EcoRI,50ед, рестриктазы Hind!!i и инку- . ры, осаждали спиртом, высушивали и расбировали при 37 С 5 ч. Инкубационную: творяли в воде. смесь пропускали через колонку с сефадек- 55 сом G-50 и фракционировали с помощью 0,5 мкг Pvull-EcoRI-фрагмента инкубиэлектрофореза в 8%. полиакриламидном ге- ровали в 10 мкл среднесолевого буфера с 5 ле, После авторадиографии вырезали из ге- ед,.рестриктазы Hindi!! в течение 1 ч при ля полосу, соответствующую фрагменту . 37 С. ДНК из реакционной смеси осаждали размером около 75 п,о., и элюировали ДНК . спиртом, высушивали и растворяли в воде.

Для получения вектора из плаэмиды зуп/pBR327 4 мкг ДНК гидролиэовали в 20 мкл инкубационной смеси на основе среднесолевого буфера, содержащей 15 ед.

PvuIl и 20 ед. Н1пбИ1, в течение 1,5 ч при

37 С. Реакционную смесь фракционировали в 1 агарозном геле и вектор элюировали, используя легкоплавкую агарозу, ДНК осаждали спиртом. высушивали и растворяли в воде.

Лигирование Рчо И-Hindi l I-фрагмента к

ДНК ГР КРС c Pvuil-Hindlll-вектором (syn/pBR327) осуществляли в 20 мкл инкубационной смеси следующего состава: 50 mM трисНСI, рН 7,6. 10 mM MgClz, 5 mM ДТТ, 0,1 гпМ спермидина, 0,05 вМ ЭДТА, 1 mM ATP.

Соотношение вектор-вставка (no молям) составляло 1;2. Реакционную смесь инкубировали с 10 ед. ДНК-лигаэы фага Т4 в течение ночи при 8ОС. Лигаэной смесью трансформировали клетки штамм Е.coll

НВ1Д1. Плазмиды из полученных клонов анализировали с помощью гидролиза рестриктэзэми. Правильность структуры подтверждали секвенированием методом

Максэма-Гилберта. В результате была отобрана плаэмида нужной структуры, обозначенная pBGH1-190.

8) Конструирование плазмиды

pBGHBal12 (фиг. 4В).

Для удаления 3 -нетранслируемого участка кДНК ГР KPC 10 мкг плаэмиды pBGH1190 гидролизовали рестриктаэой BamHI e

20 мкл инкубационной смеси на основе среднесолевого буфера в течение 1 ч при

37ОС, Линейную форму плазмиды обрабатывали нуклеэзой Ва131. Далее проводили обработку полученных ДНК фрагментом

Кленова ДНК полимеразы I в присутствии

dNTP и пришивку синтетического Hindlliлинкера 5 -CCAAGCTTGG-3 . Смесь прогревали 5 мин при 70 С, добавляли 10 ед. рестриктазы EcoRI и 30 ед, рестриктазы

Н1пбИ!и инкубировэли в течение 3 ч при 37 С.

Смесь полученных фрагментов фракционировали в 1 агарозном геле и выделяли фрагменты длиной 580-650 п.о. После переосэждения этанолом ДНК растворяли s 20 мкл воды. 5 мкг плазмиды pUC18 гидролизовэли рестриктазами ЕсоВ и Hindlll; как описано ранее. К 100 Hl pUC18, расщепленной EcoRI u Hlndlil äoáàâëÿëè 5 мкл раствора фрагментов ДНК. выделенных.из эгароэы, и проводили инкубацию с ДНК-лигазой фага Т4. как описано выше. Лигазной смесью трансформировали штамм TG1.

Клетки высевали на индикаторые чашки с

Х-gal и ИПТГ, содержащие ампициллин.

Проводили отбор белых колоний. Из. пол. ученных клонов выделяли плазмиды и опре1730150 деляли нуклеотидную последовательность 3-концевой части кДНК ГР КРС методом Сэнгера. Для дальнейшей работы отобрали плазмиду, содержащую EcoRI-Hindlll-фрагмент с геном ГР KPC размером 601 п.о.. обозначенную рВОН Ва112;

П р и.м е р 2. Получение фрагмента ДНК, кодирующего ГР овцы.

А) Клонирование фрагмента ДНК, коди10 рующего ГР КРС, в векторе М13 (фиг. 6).

10 мкг плазмидной ДНК рBGHBa112 гидролизовали рестриктазами EcoRI u

Н!пбИ1 в 50 мкл инкубационной смеси следующего состава: 50 mM NaCI, 10 mM трисНС1. рН 7,5, 10 mM MgCIz. 1 mM дитиот- рейтола (ДТТ), 10 ед; рестриктазы EcoRI и 10 ед. рестриктазы Н1пб!И, в течение 2 ч при 37 С.

Проводили разделение фрагментов ДНК в 1 $ ага- . розном геле и выделяли из геля фрагмент размером 601 п.о., используя стандартный метод.

5.мкг ДНК репликативной формы бактериофага M13mp8 гидролизовали рестриктазами EcoRI и Н1псИИ, как описано выше.

Продукты гидролиза разделяли в 1 (, агароз75 ном геле и выделяли векторную ДНК размером около 7 тыс, п.о.. Растворы фрагмента и вектора смешивали в молярном соотношении 2:1, добавляли лигазный буфер, смесь инкубировали в течение 10 мин при 65ОС. в теченине 5 мин при комнатной температуре и помещали в лед, К смеси добавляли ATP до концентрации 05 еМ и ДНК-лигазу фага Т4 (1 ед.) и инкубацию продолжали в течение ночи.

Проводили трансформацию компетентных клеток Е. coll Т61, полученных кальциевым методом.

Для.:трансформации брали 10 мкл рас-. твора, содержащего 100 нг ДН К(в пересчете . на репликативную форму ДНК фага М13вр8), смешивали раствор ДН К со 100 мкл суспен-. зии компетентных клеток и инкубировали 30

40 мин при 0 С. 1,5 мин при 42 С и охлаждали смесь во льду. Добавляли 2 мл среды YT (5 г/л бактотриптонэ, 8 г/л дрожжевого экстрактра, 5 г/л NaCI) и инкубировали 1 ч при

37 С. В стерильные пробирки разливали по 2 мл "верхнего" агара и выдерживали их в водяной бане с температурой 45 С. Добав-. ляли в пробирки по 40 мкл 100 mM раствора иэопропилтиогалактозида (ИПТГ) и 2 рас- . твора Х-gal. 100 мкл культуры Е. соИ с плот5п ностью 0.3 о.е./мл и 100 мкл суспензии трансформированных клеток. Смесь тщательно перемешивали, выливали на поеерх-, ность чашки с "нижним" агаром. Чашки инкубировали в течение ночи при 37 С. С бесцветных Фаговых бляшек, образовав шихся на бактериальном газоне, проводили заражение 2 мл ночной культуры штамма

Т61, разбавленной в 100 раз двукратной средовй YT. Культуру выращивали на качалке

1730150.10

9 при 37 С в течение 6 ч, Затем культуру центрифугировали и отбирали 1 мл супернатанта. содержащего фаговые частицы. Добавляли к супернатанту 200 мкл 20 раствора полизтиленгликоля (М.в. 6000) в 5

2,5 М растворе МаО и оставляли на 15 мин при комнатной температуре. После центри- . фугирования в течение 5 мин супернатант удаляли, а осадок растворяли в 100 мкл ТЕбуфера (50 mM трис НО, рН 8,0, 1 mM ЭДТА). 10

Раствор экстрагировали равным объемом фенола, насыщенного ТЕ-буфером и 5 объемами эфира, насыщенного ТЕ-буфером.

ДНК иэ раствора осаждали этанолом и использовали для секвенирования вставки ме- 15 тодом Сэнгера и для проведения мутагенеза.

Секвенирование 6 полученных таким способом препаратов ДНК показало, что 3 из них содержат вставку фрагмента, кодиру- 20 ющего ГР КРС. Один из них, обозначенный

mp8/bGH, испольэовали в дальнейшей работе.

Б) Олигонуклеотид-направленный мутагенеэ фрагмента, кодирующего ГР КРС(фиг. 25

7).

Дпя проведения мутагенеэа испольэовали синтетически опигон укпеотид (мутагеиный праймер), комплементарный участку гена ГР KPC. содержащий 2 точечные заме- 30 . ны. одна из котррых приводит к замене кодона GGC(Gly ) на GTC(Val), т.е. позволяет превратить ген ГР КРС в ГР овцы. Вторая замена приводит к образованию в нуклеотидной последовательноти фрагмента уча 35 стка узнавания рестриктазы Ast (5 -ОАСОТС-3 ). Структура.мутагенного праймера: 5-GGTGGTTGeCGTCTTCCAG-3 .

Фосфорилирование праймера проводили в инкубационной смеси следующего состава: 40

2 мкл 10 х буфера для полинуклеотидкиназы;

10 мкл раствора мутагенного праймера (20 пмолей/мкл):

2 мкл 10 mM раствора АТР; 45

6 мкл Н20;

1 мкл полинуклеотидкиназы фага Т4 (5 ед.).

Смесь инкубировали 1 ч при 37 С и прогревали 10 мин при 70 С. Отжиг мутагенного 50 и секвенирующего праймеров на матрице

mp8/bGH проводили в инкубационной смеси следующего состава:

1 мкл раствора фосфорилированного мутагенного праймера (10 пикомолей); . 55

0,5 мкл раствора универсального секвенирующего праймера (5 пикомолей);

3 мкл матричной.ДНК mp8/bGH (1 мкг);

1 мкл 10 х ТМ-буфера (100 mM трисНО, рН 7,5, 100 mM MgCI2);

4,5 мкл Н20.

Смесь прогревали при 80 С, медленно в течение 1 ч снижали температуру до 30 С. затем охлаждали во льду.

Реакцию пролонгирования праймеров проводили в инкубационной смеси следующего состава:

1 мкл 10 х ТМ-буфера;

1 мкл смеси dNTP с концентрацией 5

mM;

1 мкл 100 mM ДТТ;

1 мкл 10 mM АТР;

6 мкл Н20;

10 мкл смеси, содержащей матрицу и праймеры.

Добавляли 1 мкл раствора фрагмента

Кленова ДНК полимераэы 1 (5 ед.} и 1 мкл раствора ДНК-лигазы фага Т4 (2 ед.) и инкубировали в течение ночи при 12 С. Смесь разбавляли в 10 раэ раствором 10 mM трисНО. рН 8,0, 10 аМ ЭДТА и трансформировали клетки штамма ВМН 71-18 той . Для получения бактериального газона использовали штамм ВМН 71-18.

200 бляшек перекалываям на нитроцеллюлозный фильтр и чашку-реплику, инкубировали s течение ночи при 37ОС, Нитроцеллюлоэный фильтр с-колониями обрабатывали по известному методу. Фильтр инкубировапи в 10 мл раствора для предгибридизации(6 х SSC, 10Х растворДенкардта, 0.27 SDS) в течение 1 ч при 65ОС. Далее фильтр гибридизовали с меченым мутаген( ным праймером в 10 мп раствора 6Х8$С, 10

X раствор Денхардта в. течение 2 ч ври комнатной температуре. Затем фильтр отмывали 3 раза по 1 мин в 100 мл 6Х3$С и авторадиографировали в.течение 30 мин.

Далее проводили отмывку фильтра в том же растворе при 59 С и снова авторадиографировали. Для дальнейшего анализа отбирали клоны, гибридиэующиеся с мутагенным праймером. Выделяли одноцепочную ДНК и определяли нуклеотидную последовательность в участке, подвергаваемся мутагенезу. В. результате был получен бактериофаг

mp8/oGH со вставкой, кодирующей ГР овцы и содержащей новый еайт расщепления рестриктазы Aatll на расстоянии 391 п.о. от

EcoRl-сайта,.

Пример 3. Получение рекомбинантной плазмидной ДНК pOGHtrp11 (фиг. 8).

5 мкг репликативной формы фага

mp8/oGH гидролизовали рестриктазами

EcoRI и Н!пб! И, как описано ранее. и выделяли после разделения в 1$ агароэном геле фрагмент, кодирующий ГР овцы, размером

601-п.о..

10 мкг плазмидной ДНК pSTH2191 гидролизовали рест иктазами EcoRI и Hlndlll, 1730150

10

8,0, 1 mM ЗДТА, 1% SDS и инкубировали в .15 течение 10 мин на кипящей водяной бане.

35 продукты гидролиза фракционировали в геле и выделяли больший фрагмент размером

5300 п.о,.

Фрагмент и вектор сшивали ДНК-лигазой фага Т4, как описано выше, Смесью трансформировали клетки штамма Е. coli

DH1. Транформированные клетки высевали на чашки с агаризованной средой УТ, содержащей 20 мг/л ампициллина и 5 мг/л тетрациклина. Полученные клоны выращивали в

3 мл среды УТ, содержащей 20 мг/л ампициллина, в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием, суспендировали в растворе, содержащем 50 mM трисНС1, рН

После охлаждения до комнатной температуры лизаты центрифугировали. Аликвоты лизатов (10 мкл) наносили на полиакриламидный гель с SDS и проводили электрофорез по Лэммли. После электрофореза гель окрашивали Кумасси R-250 по стандартной методике. В результате анализа лизатов более чем 100 клонов был выявлен один клон, направляющий синтез полипептида с мол. массой около 22 KD, представляющего собой ГР овцы. Уровень синтеза этого белка составлял около 20% от суммарного белка клетки, Исследование плазмиды, выделенной из этого клона и обозначенной pOGHtrp11, показало, что она содержит кроме векторной части и фрагмента, кодирующего ГР овцы, дополнительный

Н1пд1(1-фрагмент ДНК размером 916 п.о,.

Этот фрагмент представляет собой часть

133-элемента E. cali и имеет нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 3.

Пример 4. Получение штамма E. coli

DH1 — продуцентра ГР овцы.

Плазмидой pOGHtrp11 трансформировали штамм Е. coli DH1 по стандартной методике и получали штамм-и родуцент ГР овцы, Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФ АН

СССР под номером B KM CR-326Д.

Содержание гормона в биомассе штамма определяли путем лизиса бактерий и измерения гормона в лизате методом иммуноферментного анализа. Накопление

ГР овцы в биомассе штамма BKM CR-326Д, содержащем плазмиду pOGHtrp11, составляло 50-60 мг на 1 л ночной культуры.

Пример 5. Анализ накопления ГР овцы в биомассе штамма BKM CR-326Д.

Штамм ВКМ CR-326Д выращивали в течение ночи в 3 мл среды YT. содержащей 25 мг/л ампициллина. Клетки осаждали центрифугированием и суспендировали в 100 мкл буфера, содержащего 100 mM трисНС1, рН 8,0, 1 mM ЗДТА и.1% SDS, Суспензию прогревали в течение 10 мин на кипящей водяной бане, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали на центрифуге "Эппендорф" в течение 10 мин при 10000 об/мин. Отбирали 10 мкл супернатанта, добавляли 10 мкл буфера, содержащего 20% глицерина, 40% Pмеркаптоэтанола, 0,2 М трисНС1, рН 7,0, 8% SDS, 0,025% бромфено- . лового синего. Образец прогревали 5 мин при 100 С и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с SDS; Электрофореграмма белков штамма BKM CR 326Д представлена на фиг, 9. Гель сканирования на лазерном денситометре UltroScan Xt фирмы LKB, Результаты обработки данных представлены в табл, 2.

Как следует из табл. 2, содержание ГР овцы в клетках штамма BKM CR-326Ддостигает 20 25% от суммарного белка клеток.

Замена глицина на валин в аминокислотной последовательности приводит к увеличению молекулярной массы ГР овцы по сравнению с молекулярной массой ГР КРС, Небольшое различие в молекулярных массах удается выявить при фракционировании соответствующих препаратов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

ГР овцы мигрирует при электрофорезе в геле медленнее, чем ГР КРС, Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК, кодирующий гормон роста овцы, полученный с помощью сайтспецифического мутагенеза фрагмента

ДНК, кодирующего гормон роста крупного рогатого скота, размером 601 п.о„имеющий следующую последовательность нуклеотидов:

1730150

14 ААт

-1 +1 +10

MET PII) PB0 ALA MLI SEB LEU SEB gLY LEU PHE AjI.P ASN Л1Л Yhj LEU

ТСТ ATG TTC ССА GCT ATG TCT СТА ТСТ GGT СТЛ ТТС GCT AAC GCT GTT СТС

+20 +ЗО

AQG ALA .giLN 1lIS .LEU I4f(GLN LEU AL)()ALA hSP THRgPlE LYS GLU P)3g()GLU

CGG GCC CAG САТ СТТ CAT CAG CTG GCT GCT GAC ЛСС ТТС AAA GAG ТТТ GhG . +40

ABG TH(t(YR 11.Е РВО Я0 С1.У С1 Н ЛЯ ТУВ 5ЕВ IL(gLN ASN THR)PN VAL

CGC АСС ТЛС АТС CCG GAG GGA CAG AGA TAC ТСС АТС CAG АЛС АСС CAG GTT

+50 +60

ALA P(IP()CYS PHE SEf,FLU TIJR ILE) g(O hLh PBO T((()GLY LYS AS(()FLU ALA

GCC ТТС TGC TTC ТСТ GAA ЛСС h I C CCG GCC ССС АСС GGC AhG ААТ GAG GCC

+70 . +80

С11 4„Я14 LY 5Е11 ЛЯ„1Е0 GLU LELJ PEU ABG 1J.Е.ЯН J.EU LEU 1.Щ ILE GLN

CAG СЛС AAA ТСА СЛС TTG GAG СТС СТТ CGC ЛТС ТСЛ СТС СТС СТС ATC CAG

+90 . +100

SElI.;l;BP LEU GLY„+tO LEU GJ.N Pllg LEU SEB ABg VAL PHE THR. ôN SER LEU

1О. тбс стт ссс ссс стс слс ттс стс лсс лсл стс ттс Асс ААс лсс ттс

+110

Y$f PHE G1Y TNI4.„)EB A P ABG (PL TYB GLU Lgy LEU LYS AS) $EU GLU GLU

С4ТС ТТТ GGC АСС TCG GAC CGT GTC ТЛТ GAG ЛЛС СТС hh(GAC СТС GAG GAA

+120, . +130

ILE LEU hI,,LEO MET ARg FLU LEU GLU gP YAL THB P(P .ABG ALA GLY

GGC АТС CTG GCC CTG hTG CGG 6ЛС CTG GAA GAC GTC ЛСС ССС CGG GCT GGG

+1 10 +1 50

С 14 ILE LEU„L "LN THB TJ)t ASI LYS 11, 1 TllB ASNgT ABG SER hg

СЛС АТ1 СТС ЛЛС САС1 ЛСС ТЛТ GAC AAh TTT СЛС ЛСЛ ЛЛС ЛТС ССС АСТ СЛС

+160

Л Р А1Л 1-Е,(Е11 1-У Л514 B GLY LEU L)1) ЕН СУ Р 1,Е14 1У Л11 .Я11

САС G(G Cl G С i C AAG AAC ТЛС ССТ С1 G СТС ТСС TGC 1 ТС CGG АЛС GAC СТО

+170 +160

HIS LYS l lJB «1.11 TIIB 1УД. I EU AH(. YAL gg f LYS CYS APg ABG PIIE GLY FLU

САТ: АЛС АСС САС АСС1 ТЛС СТС АСС СТС ЛТС ЛАС ТСС ССС ССС ТТС ССС СЛС

+ 1 90

Л1.Л SEB ЯБ ALA PtiE Stye

GCC hGC ГС.! GCC IТС TAG TTGCCAGCCATCTGffG11

2. Рекомбинантная плаэмидная ДНК

pOGHtrp11, кодирующая синтез гормона роста овцы, размером 6800 п,о.. содержащая:

EcoRI-Hind lll — фрагмент плазмиды

pSTH2191 размером 5300 п,о.:

EcoRl-Hind 1И вЂ” фрагмент, кодирующий гормон роста овцы, размером 601 п.о.;

EcoRI-Hind Ill — фрагмент IS3-элемента размером 916 п,о.;

1 участок расщепления рестриктазы

EcoRI;

1 участок расщепления рестриктаэы

Ява1, расположенный на расстоянии 427 п.о. от EcoRI-.ñàéòà;

3 участка расщепления рестриктазы

Pstl, расположенные на расстоянии 300, 1353 и 5095 п.о. от Есор-сайта;

2 участка расщепления рестриктазы

Hind Ill, расположенные на расстоянии 601 п.о. и 1517 п.о. от EcoRT-сайта;

1 участок расщепления рестриктазы

EcoRV, расположенный на расстоянии 1673 п.о. от EcoRI-сайта;

5 1 участок расщепления рестриктазы

BamH1, расположенный на расстоянии 1863 п.о. от EcoRI-сайта;

1 участок расщепления рестриктаэы

SalG1, расположенный на расстоянии 2138

10 п.о. от EcoRI-сайта;

1 участок расщепления рестриктазы

Hpal, расположенный на расстоянии 6784 п.о. от EcoRI-сайта; генетические маркеры:

15 bla-ген, обеспечивающий синтез Р-лактамазы — устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1200 до 2100 п.о. против часовой стрелки от Hpal-сайта;

tet-ген, обеспечивающий устойчивость к

20 тетрациклину, расположенный в участке от

1500 до 2500 п.о. по часовой стрелке от

EcoRI-сайта:

1730150

Таблица 1

Положения сайтов рестрикции на физической карте рекомбинантной плазмидной ДНК pOGHtrp11

Таблица 2

Уровень синтеза ГР овцы клетками штамма ВКМ CR — 326D (Е,coll DH1/hOG Htrp11) перед последовательностью. кодируещей 3. Штамм бактерий Escherichla coll гормон роста овцы, расположена промотор- BKM CR-326Д вЂ” продуцент гормона роста наяобластьтриптофановогооперона Е, coll. овцы, 1730150

-1 +1 10 . ЛЛТ

h1F1 PJJ) PH0 hLh MJ, EH LEU SER PLY LEU PJJE A/) ASN ALA VA$ LEU

ТСТ АТС ТТС ССА ССТ АIG TCT CTA TCT GGТ СТЛ TTC GCT ЛАС GCT GTT CTC

+20 +30

ARG ALA gLN JIIS LEU J)$) GLN LEU AL$()ALA hSP THR PJE LYS GLU Pф С1.11

CGG GCC CAG CAT СТТ СЛТ CAG СТС ОСТ ССТ GAC ACC ТТС.ААЛ GAG ТТТ СЛЬ

AHG TJJ(1 Рн ILE PB0,lehu GLY Сщ hycATYR SER 1Ч gLN ASN THR Ик VAL

CGC АСС ТЛС ЛТС ССС СЛС GGA CAG AGA ТАС TCC АТС CAG АЛС АСС CAG GTT

+50 +б0

ALA РфоСУЗ РНЕ SE(PU ТНН ILEgP0 ALA РВО ТЯ С1.У ЕУБ АЩоД1.0 ALA

GCC ТТС ТСС ТТС ТСТ GAA ЛСС ЛТС ССС ССС ССС ACG GGC АЛС ААТ GAG GCC

+70 .+80

СЕМ„ЯМ LYS SEB ЛЯ„!.ЕУ СК LE/ (Е0 hBG 1!.ЕЯВ 1.EU LEU LfP ILE GLN

CAG CAG AAA ТСЛ СЛС ТТС GAG CTG СТТ ССС ЛТС ТСА CTG СТС CTC АТС. CAG 90 +100

SEf1.fHP 1EU GLY gO LEU GJ.N Pgg LLU SEB AH((AL PlIE THH. @N SEH LEU

ТСС ТС : СП ССЬ ССС СТО СЛС ТТС СТС ЛСС ЛСЛ СТС ТТС АСС ААС АСС ТТС

+110

"Но""" "" Т"1 -о " "" " эй " "" "Ло" " """" " 45

GTG TTT GGC ЛСС ТСС СЛС ССТ СТС ТЛТ СЛС ЛАС СТС ЛЛС САС СТС САС ОАА

+120 . +130

{j$g ILE 1.Ю Л,LEU MET Лвд,УЮ LEU GLU ЛР Ча. Тйя ЩУ,AHG ALA GLY

GGC ATC CTG ССС СТ< h rG ССС GAf CTC Ghh GAC GTC ACC ССС CGC GCT GGG

130 +150

GLN ILE LEU 8 GLJJ П1Й T,ASP LYS РИ „ Р TJJR ASN @Т AHG SEH AgP

CAG A Jt СТС ЛЛС СЛС ЛСС ТЛТ СЛС ЛАЛ Т 1 T GAC ЛСА ЛАС .ATG CGC AGT СЛС

«1ЕО

ASP А1.А LEg 011 LY ASJJ„QB 1Л LEU 1йоSER CYS «%,ВПАВ LYS ASP И11

GAC АСС СТ С C J C ЛАС ЛЛС l ЛС GGT СТО СТС ТСС ТСС ТТС CGr, AAG GAC СТС

+170 +.1 80

Н11 1.1 1 11,Е ТНй 1 11 Ай . Л1. 1 1 1. 8 С 5 Л@ ЛПС Р11С С1./ 1.11

CAT AAG ЛСС GAG ЛСС 1 ЛС CTG AGG .СТС ЛТС AAG TGC ССС CGC ТТС GGG GAG

"190

ALA SEB Я ALA PltE 5180

GCC hGC ТС1 .ССС ТТС TAG ТТСССАСССЛТСТСТТСТТ

Фиг f

1730150

l0 20 ЗО 40 50 60

AAGCTTGCTGAACGCATCGGTGTTACTGCCGCAGCCCGTGAACTCAGÑÑÒÑÒÈÒÑËÀÒÑË

70 00 90 100 110 120

CAACTCTACAACTGGCGCAGTAAACAGChAAATCAGCAGACGTCTTCÒÑÀÀÑÑÒÑËÀÑÒÑ

130 140 150 160 170 180

GAGATGTCThCCGAGATTGCACGTCTCAAACGCCAGCTGGCAGhACGGGATGAAGhGCTG

190 200 210 220 230 240

ССТЛТССТССАЛЛЛСССССССЛСЛТАСТТССССЛЛСССССТСЛЛАТСЛAGTATGTCTTTA

250 260 270 280 . 290 300 .

TTGAAAhACA7ChGGCTGAGTTCAGCATCAAAGCAATGTGCCGCGTGСТСССССТССССС

310 320 330 340 350 360

GCAGCGGCTGGTATACGTGGTGTCAGCGGCGGACAAGGATAAGCACGCÑÒÑÀGÑÀÑÒÒÑÑ

370 380 390 400 410 420

GCCAhCACTGCGAChGCQTTGTCCTCGCGGCTÒÒÒËCÑCÑÑÒÑÀÀÀАСЛСССТТАСССТС

430 440 450 460 470 480

CCCCACGCCTGhCGGhTGAACTGCGTGCTCAGGGTTACCCCTTTAACGTAAAAACCGTGG

490 500 510 520 530 540

ССССЛЛСССТССССССТСЛСССЛСТСЛССССЛЛЛССССТСССССAA TTCAGCCCGGTCA

550 560 570 500 590 600

ССТЛССССССЛСЛСССССТСССТСТСТСЛСЛЛЛЛТСТСТТ(CACCA(СЛТТТТТЛССССА

010 620 630 640 650 660

СТССССССЛЛССЛСЛЛСТССССЛССЛСЛСЛТСЛССТЛСТТЛССТЛСАСЛТСЛЛ< (:СТ(:СС б70 600 690 (00 710 720

TGThTCTGGCAGTGGTCATTGACCTGTGGTCACGTGCCGTTATTGGCÒÑÑÒÑËËÒÑÒÑÑÑ

730 . 740 750 7бО 770 780

CACGCATGACGGCGCAACTGGCCTGCGATGCCCTGCAGhTGGCGCTGÒÑÑÑÑÑÑÑÒËËÑË

790 800 810 820 830 840

ССССССССЛЛССТТАТССТТСАСЛСССИСССТССАССССАСТАСТСТТСЛССЛСАТТАТС

850 860 870 880 890 900

AGGCGCAhCTGAAGCGGCATAATCTGCGTGGAAQTATGAGCGCAAAAGGTTGCTGCTACG

ATAATGCCTGCGTGGA

Е Н

А Pv синтетический фрагмент ДНК аза

1730150 тичный ролиэ)

unazzz т4ЛФ ж газа

Фиг.4 б

EAPv

EV

1 ° 3amHI

2i 3al31 фью

З.KnaIII-ЛИНКВР, Т4 ЛНК ЛИГаза

4.НФлйХХХ, EcoRX

1730150 г !

И в г- ь-) О

Г) r » 1 r > ц r,-r

° » )

»»;, D ч г;»

<р Р

>-4 о сс :ф

i o

Aq=

Mо с)о ф

Йс

) сз о

e LCйо

) о

° »

И f ra

) t1

,в с

) Г4

) сЭ

) о д

Р4 о юо

f o

} . ) f « »

-«) е1 f;4

gj сФ. о н с )-!

o )

« ° :)

) «3

)o . "! cdс. -! t =э., 8)н )о ео)н. ) о ,с» с4 ) f-f с Ф

) M

lo н 1о) н) »г г) »»

Ф г

) rg»

)С4 о-)

4 О

Р о н

) «

f, )н ) с- ео ,с,»

Р С-<

+ с

Q) с-1

Ъ- °

С4 С4 ест д о г >СЕ -) с

». » rQ»ÿ г- и с-

ЛИ

Р 4

Ф CH йо

hH ао

И Е Л

Ф (-.1 ..»» Г» с

) С )-)

) с c) 1730150

1730150

Ютагаший пса!!:.:ер, ФРОГ;.fpitT Ьлоцоп=..

БЕ полл:.оратаи I, Т4 ДБ лилаза

- элвмента

Составитель Т.Забойкина

Редактор А.Лежнина Техред М.Моргентал Корректор В.Гирняк

Заказ 1489 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101