Способ определения цитотоксичности бактерий

 

Изобретение относится к области микробиологии и может использоваться для определения и изучения биологических свойств бактерий, отбора вакцинных штаммовпродуцентов цитотоксинов, прогнозирования тяжести течения заболеваний и оценки эпидситуаций. Сущностью изобретения является упрощение, повышение точности и эффективности технологического процесса. Для этого органную культуру эпителиальной ткани инкубируют со взвесью бактерий и центрифугируют при определенной ориентировке - горизонтально над предметным стеклом, что обеспечивается размещением органной культуры в специальном проволочном контейнере, а учет цитотоксичности проводят после подсчета слущенных на покровное стекло эпителиальных клеток по формуле. & и

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12. N 5/00, 7/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ЙЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г1РИ ГКНТ СССР

»»

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (J . „!

>7

Ф%

О» О

»Ф

Ф

С4

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ6СТВУ

31) 4767514/13

У2) 08,12.89;

46) 15.07.92. Бюл. N.. 26

71) Киевский научно-исследовательский инетитут эпидемиологии и инфекционных боязней им.Л.В.Громашевского

: . (72) А.Ф.Фролов, Л;В.Пархоменко, В,П.Жалko-Титаренко, Л.В.Тимохина и Ю.П,Галагуза (53) 576.8.097.29 (088,8) (56) Мауаи В,С. ет al. J, Med. Mlcroblol„v. 24; и. 3, р. 197. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧ Н ОСТИ БАКТЕ P ИЙ (57) Изобретение относится к области микробиологии и может использоваться для onИзобретение относится к биологии и медицине. а именно к медицинской микробио:. логии, и может использоваться для выявления патогенных свойств микроорганизмов и изучения их биологического действия.

Цель изобретения.— упрощение и повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем; что органную культуру кишечника или другого, эпителиального органа культивируют в жидкой пйтательной среде в присутствии цитотоксической суспензии бактерий в контейнере над покровным стеклом, затем цейтрифугируют и по количеству отслоившихся клеток определяют цитотоксичность

С по формуле

С = — (1 — — )

N g>

go 1 где N — количество отслоившихся при центрифугиоовании клеток, подсчитанных на

1,96 мм по диагоналям покровного стекла;

Ы2,, 1747483 А1 ределения и изучейия биологических свойств бактерий, отбора вакцинных штаммов — продуцентов цитотоксинов, прогнозирования тяжести течения заболеваний и оценки эпидситуаций, Сущностью изобретения является упрощение, повышение точности и эффективности технологического процесса, Для этого органную культуру эпителиальной ткани инкубируют со взвесью бактерий и центрифугируют при определенной ориентировке — горизонтально над предметным стеклом, что обеспечивается размещением органной культуры в специальном проволочном контейнере, а учет цитотоксичности проводят после подсчета слущенных на покровное стекло эпителиальных клеток по формуле.

go — ускорение центробежной силы отслоения клеток, не обработанных цитотоксической суспензией бактерий;

g) — ускорение центробежной силы отслоения клеток, обработанных цитотоксической суспензией бактерий;

t — время воздействия цитотоксической суспензии бактерий, ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. В центрифужную пробирку емкостью 25 мл помещают 20 мл жидкой питательной среды(N. 199, Игла), в которую помещают проволочный контейнер с закрепленными в нем горизонтально на расстоянии 1 см двумя параллельными предметными стеклами, К нижней поверхности верхнего стекла биоклеем приклеивают органную культуру — отмытый физиологическим раствором фрагмент кишки кишечника мыши 1,0 Õ1,0 см, Можно ис3

1747483 пользовать органную культуру человека или Результаты исследований приведены в животных, Размещенную таким образом си- таблице,— стему инкубируют 15 мин в термостате. Из полученных данных видно, что предЗатем пробирку с органной культурой лагаемый способ более чувствителен чем изцентрифугируютвдискретном режиме воз- 5 вестный, так как позволяет определить растающих ускорений центробежной силы цитотоксичность, когда известным способом и определяют gp — "ускорение, при котором она не определяется. Способ дает возмождостигается полное отслоение эпителиаль- ность проводить определение в количественных клеток интактной органной культуры ном выражении, что значительно точнее (контроль). Для использованной органной !0 известного.Точностьпредлагаемогоспособа культуры кишечника мыши go составляет составляет 100%, известного 40%, Кроме то270g.: го, для осуществления способа не требуется

Затем в четыре опытные пробирки с дорогостоящихреактивовиоборудования,он идентичной культурой вносят суспензию отличается простотой, так как включает семь штамма S.dysenteriae 720/69(Институт Па- 15 несложных технических приемов и занимает стера) в концентрации 5 10 КОЕ/мл, инку- 4,75+ 0,51 на 1 определение (известный спо. бируют в термостате при 37 С в течение 30 соб — 32 технически сложных приема и мин, центрифугируют и находят минималь- 4,5i 0,57 сут соответственно). ное ускорение, йри котором происходит от- Таким образом, предлагаемый способ . слоение клеток эпителия, После .20 более доступен для широкого исследовацентрифугирования покровные стекла с от- ния, по сравнению с электронной, особенно слоившимися клетками осторожно извлека- сканирующей микроскопией, ют, подсушивают, фиксируют., красят по

Романовскому-Гимза и подсчитывают коли- Предлагаемое определение цитоток чество клеток по диагоналям покровного 25 сичности в количественных показателях дастекла на площади 1,96 мм . На четырех ет возможность проводить объективную . опытных стеклах подсчитано соответствен- оценку свойств штаммов микроорганизмов, но 200, 184, 202; 182 клетки. Полученные особенноэнтеробактерий,отборотдельных

: данные подставляют в формулу и определя- штаммов, продуцентов цитотоксинов для ют цитотоксичность. В опытных пробирках 30 эпителиальной ткани, вакцинных штамцитотоксичность-составляла 135, 133, 123, мов, штаммов для моделирования инфекци121. Таким образом средняя и ошибка сред- он н ы х процессов, а также и ро водить ней с вероятностью 95% для четырех опре- типирование штаммов и прогнозирование делений составляет 128 6,4.. тяжести течения заболеваний.

Пример 2. Согласно предлагаемому 35 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я способу определяют цитотоксичность Способ определения цитотоксичности. штамма S.fiåxïåã! N 516, Отслоение эпите- бактерий, включающий исследование кле лиальных клетоК после цитотоксического ток тканей, отличающийся тем, что, с

- влияния штаммавчетырехопйтахотмечено целью упрощения и повышения точности при 150 g в количествах 121, 147, 145, 123 40 способа, органную культуру эпителиальной ,клетки на 1,96 мм, что соответствует при ткани инкубируют 5-60 мин в присутствии подсчете по формуле показателю цитоток- цитотоксической суспензии бактерий в консичности 119,4+ 12,45 (средняя и ошибка центрации (5-8)10 КОЕ/мл в контейнере средней с вероятностью 95% для четырех над покровным стеклом, затем центрифугиопределений). 45 руют и по количеству отслоившихся клеток

Пример 3. Согласно предлагаемому определяют цитотоксичность С по формуле способу определяют цитотоксичность . N у) штамма Е.со!! М17,,по данным ряда иссле- Т go дователей не обладающего цитотоксично- где N — количество отслоившихся при центстью. Концентрацию бактериальной 50 рифугиоовании клеток, подсчитанных на суспензии увеличивают до 8 10 KOE/мл, 8 1.96 мм по диагоналям покровного стекла;

8 остальном определение проводят аналогич- gp — ускорение центробежной силы отно примеру 1. Показатель цитотоксичности слоения клеток, не обработанных цитотокпо четырем определениям соответствовал сической суспензии бактерий;

12- 5,2, подтверждая отсутствие цитотоксич- 55 g> — ускорение центробежной силы отностй данного штамма. слоения клеток, обработанных цитотоксичеПример 4. Проводят определение ской суспензией бактерий: цитотоксичности 12 различных штаммов t — время воздействия цитотоксической бактерий по предлагаемому и известному:. суспензии бактерий, ч. способам.

1747483

* Даны средние и ошибка средней для четырех измерений.

Составитель С,Пылова

Техред М.Моргентал . Корректор M.Äåì÷èê

Редактор С;Лисина

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2473 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5