Способ определения функциональной зрелости иммунной системы телят

 

""МВ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИ ЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я>5 С 01 К 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4858065/14 (22) 07.08,90 (46) 07.06,92, Бюл, N. 29 (71) Институт зоологии и физиологии

А,-! МССР (72) Е.В.Баева (56) Авторское свидетельство СССР

hb 1422153, кл. 6 01 К 33/53, 1985. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЗРЕЛОСТИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ТЕЛЯТ

Изобретение относится к лммунофизиологии и может быть использовано в ветеринарной иммунологии для определения функциональной зрелости иммунной системы жлвотных.

Существующие методики определения состояния иммунной системы животных не учитывают понятие ВозрастнОЙ нормы, При рождении у млекопитающих иммунная система еще функционально не созрела, поэтому показатели, которые свидетельствуют о наличии патологии у взрослых, являются нормальными для новорожденных жиВО" тных и наоборот. В практическом животноводстве важной является идентификация возрастной нормы",так как выращивание животных в условиях промышленных технологий способствует рождению функционально незрелого потомства, которое подвержено инжекциям и относится к группе риска.

Известен способ определения иммунодифицитнОГО состояния, сОГласно KQTclpQMY

Определяют оббемное сОДер>кание паренхи мы тимуса стереометрическим методой, (57) Использование: иммунофизиология, ветеринарная иммунология. Сущность изобретения: определяют синтез ДНК в мононуклеарах периферической крови по включению Н-тимидина в культуру лимфо3 ци>ов периферической крови, прл этом его значение в пределах 1600-2800 имп./мин соответствует функционально зрелой иммунной системы. 2 табл. числа тимических телец вдольке, учитывают возраста пациента и рассчитывают диагностические показатели, Однако, данный способ легкодоступен при проведении патологоанатомических исследований и не может быть использован для прижизненной Оценки состояния иммунной системы в раннем постнательном онтогенезе.

Цель изобретения — повышение радиологичности способа эа счет прижизненного определения функциональной зрелости иммунной системы телят, Цель достигается определением спонтанного синтеза ДНК в культуре лимфоцитов периферической крови по включению в молекулу Н-тимидина.

Спасо" осуществляется следующим образом.

Определение спонтанного синтеза ДНК

В мононуклоарах периферической крови (МПК) у новорожденных телят состоит иэ нескольких этапов, включающих; получение суспензии МПК, культивированле клеток, подсчет интенсивности синтеза ДНК, оценка. результатов.

Получение суспензии МПК, Суспензи(о МПК палуча(от путем одноступенчатоГО це((трифугираван((я reпяпинизированнай (40 ед/ In) крови в градиенте плотности флколл-верографин (плотность

Гаадиента 1,07 7, Г(риГОтовлен наго Н3 р3с творе Хе5(кса без добавnGHH5I индикатора), 1 емпература град(лента +8-10OС, Само цечтрифугироваиие желательно проводить в рефрижераторной центрифуге при 1500 об/мин В те-IQ5II!030 ми!.. Полученные мо! онуклеары Отмыва(от ат градиента дваждь! охлажденной средой 199. ЖизнеспасобHocTb клеток аце((ивается триг(3((авым синим и Должна составл>1ть 90-95%.

Клсточ!(у(О Взвесь разбавля(ат культчральной средой, доводя концентрацию клеток до 1-5 х 10 кл/Mn. б

Культивирование клеток, Для культивирования MПК используется пи ятепвная среда следу(ащего состава, среда Игла с 1000 мг n бикарбоната натрия

100 ед/мл пенициллина, 100 5(к(/мл стрептомиЦина, 2 мкГ/5ил Глутс(мина, 5 /() змбр5(0нальной теля (! ей сыворотки.

После разбавления клеток питательной средой гю 20 мкл клеточной суспензли по.мещают в плексиглассавые пла5(шеты с лунками и инкубпру(аг В течение 72 ч при 37 С.

Подсчет и((те5(,",5(57((ос r!(, синтеза ДН К, 33 4 ч до ОкОнчания 12-часОВГ Й инкубации к"пь-qi МПК I>,lкультуральную среду добавляют Н- т(лмидин в малярной активности iü мКи, мл, После QKQHчания инкубации клеток, суспензии переносятся на мемб17анные фильтрь|, п130м IB3ioT хОлОДной TYf, фиксируют В зтаноле и осваосждаi0Tc5l оТ остатков Bopbl в cMGc((этанал зфир, Фильтры помещают в радиацианные виал ы и заливаю! 10 мл сц(л нтилл 5! Ц(лан ((ОЙ жидкости. Радиоактивность кислотонерастворимой фракцли подсчитывают на сцлнтилляционнам бетаспектрометре.

Оценк", результатов.

Результат учитыва(от ПО вкл(0 (е((и(0

Н--;имидина в МПК, выража(ощийся В имп /мин (I3 (0 (Озеток

Как пака"-ал ретроспективный аналлз заболеваемость животных после рождения зависит от .пан ганного синтеза ДНК в МПК.

Данные представлены в табл, 1.

ДОКЯЗЯТЕЛЬСТВОМ Того, 5!TO ВЫСОКИЙ Йли низклй спонтанный синтез ДНК в МПК ноB0p0>(($GJiных телят являе ся г(ризняком HGдостато гна созревшей иммунной системы явля(отся данные о времени становления других показателей иммунной системы, приведенных в табл, 2.

Формула изобретения

Способ определения функциональной зрелости иммунной системы телят путе!.! исследования образца ткани с последующим выявлением оценочного показателя, о т л ич а (о шийся тем, чта, с целью повышения физиологичности способа за счет прижизненного определения функциональной зрелости иммунной (;истемы, в качестве образца ткани исследуют фракци(а ли(лфоцитов периферической крови, и ри зтом и роВадят инкубацию л(лмфоцитав В течение 72

s B п17исутствии Н-тимидина с малярг(ай активностью 15 МКи/мл, который добавляют K кле1 кам за 4 ч до окон ания инкубации, затем осажда(ат на мембранные фильтры, обрабатывают трихлоруксус(-loA кислотой, измеря(о Г радиактивность кислотснераст45

5 Пример 1. У новоро>кденно! о теленка

B стерильную пр" áèðêó с гепарином берут 5 мл краВи, До проведения исследований (до 5-8 ч) пробирка с крОВЬ(О хг73н лтся в xoJ(O HnbH(ii10 ке. ЦО5(тр(лфугированием в однаступенчатом градие((те фиколлвераграфин получа(от суспензию МПК, 015",bIBriloT клетки B холодной среде 199.

QiJGIHNB3GTc51 жизнеспособность клеток 15 трипанавым синим, >х10 клеток добавляют г в пл3((øeÒbI с абОгагцен ной питательной средой. летки инкубиру(от в тече((ие 72 ч при 37 С, За 4 ч до окончания инкубации

ДООЯBnii!OT Н ТИМИДИН, ПОСле OKOH!(35((15I

20 инкубации клетки Оса>кда(от на мембранные фи(ьтры, промыва(от и подсчитыва;ат радиоактивность кйслото((ерастворимой фРЯКЦИИ.

Е-..ли показатели синтеза ДНК в МПК

25 1600-2800 имп,/(лин, теленок родился с имM$IkI(I(7ii c IcTGMoA, cooTBGTc1 ВУ(ОЩВЙ! QBHHQ му пер(иоду его развития.

Если показатели выше или 1что хуже) ниже, то иммунная система животного фун30 кциональна незрела и теленок подвер>кен инфекциям, ега относят к группе риска, Способ позволяет проводить pGHH(010 диффаренциаци:0 животных по степени зрегасти имMóHHай системь(, что дает Воз35 мо>кнасть IJeneII3rip3Bnei(;(o проводить профилактические мероприятия, Выяв((ть группы риска и прогнозировать состояние

ЗДОООBья поГах(ОВья, Число ложно-пало>кительных определе40 ний 19%; ложно-отрицательных 14%, воримой фракции и пои ее значении 1600- функциональную зрелость иммунной систе2820 имп/мин на 10 клеток определяют мы телят.

Таблица 1

Спонтанный синтез ДНК в МПК, имп/мин

Группы животных

958 + 86

2209 ч- 310

770-1150

1600-2800

3200-4600

2800-3850

400-650

Таблица

Показат ень Т-ли ень В-ли

Составитель E.Áàåâà

Редактор Н,Химчук Техред M,Моргентал Корректор M.Øàðoøè

Зака- 2766 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР .113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101

Половозрелые КРС

Новорожденные телята, незаболевший

Новорожденные телята, впоследствие {чере

5 — 7 дн) заболевшие гастроэнтеритом

Новорожденные телята, впоследствие эаб левшие ОРЗ

Новорожденные телята, впоследствие эаб левшие бронхопневмонией

3986 + 352

3265 + 259

580 й65