Штамм бактерий rноdососсus еryтнrороlis - продуцент эпоксидирующей монооксигеназы

 

Использование: может быть использовано для получения 1,2-эпоксидов из газообразных алкенов. Сущность изобретения: штамм выращивают глубинным способом на питательной среде следующего состава, г/л: NH4CI 1,5; MgSO 1,0; СаСДО; FeS04 «7Н20 0,004; 2 мл Na-фосфатного буфера, рН 6,8; 2 мл микроэлементов по Пфеннингу, рН среды 7,0. Культивирование проводят в колбах , из которых предварительно откачивают воздух и замещают на смесь пропан-воздух

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/04, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к г ° н,к

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

/ (21) 4877382/13 (22) 23.10.90 (46) 07,08.92. Бюл, N 29 (71) Институт биохимии им, А.Н.Баха (72) АкМ.Безбородов и А,К,Куликова (56) Нои С.Т., Patel R., Laskin А.I., Barnabe N;, Barist Y. — Appl. Environ Mlcrobiol., 1983, ч.46, р,171 — 178.

Woods N.„MurråII J. — J. Gen. MIcrobiol., 1989, v. 135, Part 8, р. 2335 †23, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ RHOOOCOCCUS

ERYTHROPOLIS — ПРОДУЦЕНТ ЭПОКСИДИРУЮЩЕЙ МОНООКСИГЕНАЗЫ (57) Использование: может быть использовано для получения 1,2-эпоксидов из газо- образных алкенов. Сущность изобретения: штамм выра щивают глубин н ым способом на питательной среде следующего состава, г/л: NH4CI 1,5; MgS04 1,0; CaCI 0,2, FeS04

7Н20 0,004; 2 мл Ма-фосфатного буфера, рН

6,8; 2 мл микроэлементов по Пфеннингу, рН

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, растущего в аэробных условиях на питательной среде, содержащей пропан в качестве единственного источника углерода и энергии и синтезирующего э поксидирующую монооксигеназу.

Известны пропанутилизирующие микроорганизмы, относящиеся к различным родам, растущие в атмосфере пропана как единственного источника углерода и сйнте= зирующие эпоксидирующую монооксигеназу, активность которой составляет 0;4-2,8 мкмоль окиси пропилена в 1 ч на 1 мг клеточного белка.

„„Я „„1752767 А1 среды 7,0. Культивирование проводят в колбах, из которых предварительно откачивают воздух и замещают на смесь пропан-воздух (1:1), Температура культивирования 2830 С, Через 3 сут роста определяют активность клеточной суспензии. Во флаконы емкостью 10 мл, закрытые резиновыми пробками, вносят 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 мг сухих клеток. 8оздух иэ флаконов удаляют шприцем и замещают на газовую смесь пропилен-кислород (1:1), Флаконы помещают в термостатированную качалку при 35 С. Через 30, 60, 120 мин флаконы охлаждают, центрифугируют при

5000 об/мин и супернатант наносят на хроматографическую колонку, заполненную порапаком Q. Активность выражают в микромолях образовавшейся окиси пропилена в 1 ч на 1 мг клеточного Gemma. Обнаружено 0,18 кг окиси пропилена,, что соответствует активности 2,5 мкмоль/ч мг белка.

Известен также пропанутилизирующий (Я штамм Rhodococcus rhodochrous PNXb обладающий активной пропаноксигеназной ферментной системой и катализирующий 0 образование эпоксида (1,2-эпоксипропанэ) из пропилена. Активность экпосидирующей моноокаигенаам составляет 0.63 мкмоль ), а окиси пропилена в 1 ч на 1 мг белка., а

Цель изобретения — получение нового штамма бактерий, обладающего более высокой активностью эпоксидирующей моно- оксигеназы.

Штамм бактерий Rhodococcus

erythropoIis ВКПМ $-925 выделен методом накопительной культуры из почвенных образцов и получен путем длительной индуци1752767

4 рованной селекции к пропану как единственому источнику углерода и энергии при росте на минеральной среде, Штамм Rhodococcus erythropoiis B K(1M

S-925 имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки, Среды для хранения — МПА и минеральные среды с пропаном в качестве источника углерода, Характерной особенностью отобранного штамма является рост на всех твердых питательных средах (суслоагар, глицериновый агар, мясопептонный агар (МПА), среда Чапека) с образованием колоний кремового цвета с розовым оттенком, который при многократных пересевах на среду Foster, Davis (1966) и выращивании

s атмосфере пропан-воздух приобретает оранжевый оттенок, При росте на сусло-агаре и МПА через 12-16 ч клетки культуры прямые, слегка искривленные, иногда слабоветвящиеся, часто расположены V-образно, реже одиночно, размер клеток (0,6-1) (6 — 8) мкм, через 16 — 24 ч клетка укорачивается до кокковидных, что является характерным признаком рода Rhodococcus, грамположительны, неспороносны, некислотоустойчивы.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, оптимальная температура роста 28—

30 С, рН среды 6,8 — 7,2, при 45 С не растет.

Хорошо растет на минеральных средах в атмосфере пропана; метан не утилизируется микроорганизмом; хорошо растет в присутствии пропилового, бутилового спиртов, пропилен не является ростовым субстратом; усваивает моносахара, содержащие 6 атомов углерода, дисахариды (сахароза, мальтоза, лактоза). Углеводороды с длиной цепи С5-Cls не ассимилируются, не усваиваются арабиноза, ксилоза, не гидролизуется крахмал. Субстратами также могут служить ацетат, пируват, цитрат, Штамм при росте на пропане образует такое же количество биомассы, как и на легкоутилизируемых сахарах, При глубинном культивировании предпочтительным источником азота являются соли аммония.

Штамм непатогенен. При росте на пропане культура обладает активной монооксигеназной ферментной системой, катализирующей превращение газообразных алкенов (этилена, пропилена) в окиси алкенов (1,2-эпоксиды), Культуру штамма хранят в эксикаторе в атмосфере пропан-воздух в объемном соотношении 1:1, в качестве источника пропана используют бытовой пропан, температура хранения 4 С, на среде Foster, 0avis (1966), следующего состава, г/л: МаМОз 2,0;

МагНРО4 0,21; NaHzP04 0,09; MgSO< 7НгО водят глубинным способом на среде следующего состава, г/л: NH4CI 1,5; MgS04 1,0;

CaClz 0,2; FeSO4 7НгО 0,004; 2 мл Na-фосфатного буфера рН 6,8 (КагНР04 107 г/л, 35 КНгР04 39 г/л), 2 мл микроэлементов по

Пфеннингу (Трилон Б 500 мг; FeSO4 200 мг;

ZnSO4 7НгО 10 мг; Ми С1г ° 4HzO 3,0 мг;

НзВОз 30 мг; CuSO< 5НгО 1,0 мг; МС!г

6НгО 2,0 мг; CoClz 2HzO 20 мг; НгО 500 мл), 40 рН среды 7,0, Стерилизация среды 0,5 атм, 40 мин, Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл на качалке, делающей 200220 об/мин, при температуре 28-30 С в течение 3 сут, В колбы вносят по 100 мл среды, 45 инокулируют суспензией культуры, выросшей на косяках в атмосфере пропана в течение 10-14 сут. Из колб откачивают воздух и заполняют газовой смесью п ропан — воздух.

Рост культуры при глубинном культивирова50 нии определяют по образованию мутности, оптическую плотность (ОП) которой определяют при 600 нм. Через 3 сут роста ОП культуры составляет 1,2-1,4. Выросшие клетки отделяют центрифугированием при

55 4 С при 10000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную клеточную биомассу дважды промывают охлажденным 0,05 М Ма-фосфатным буфером рН 7,0, затем суспендируют в этом же буфере в таком количестве, чтобы 1 мл буфера содержал 10-15 мг сухих

0,2, KCI 0,04; CaClz 0,05; FeSOq 1 мг; CuSO4

0,01 мг; НзВОз 0,02 мг; MnSO40,02 мг; ZnSQ4

14 мг; МоОз 0,02 мг; агар 2%, рН 7,0, в течение 3 мес, однако желательно более часто пересевать на свежую среду (через 2 нед).

Для размножения культуры используют среду, приведенную выше. Косяки, засеянные культурой и закрытые ватной пробкой, помещают в эксикатор, из которого удален воздухи замещен на газовуюсмесь пропан— воздух. Эксикатор помещают в термостат при 28 — 30 С. Рост культуры продолжается в течение 10 — 14 дней, после этого культуру используют в работе, Оставшиеся косяки с выросшей культурой хранят в эксикаторе в атмосфере пропана при 4 С. При глубинном культивировани на минеральной среде с пропаном в качестве источника углерода и энергии через 72-96 ч штамм Rhodococcus

erythropoIis ВКПМ S-925 образует биомассу в количестве 0,7 — 1,0 г на 1 л культуральной жидкости (по сухому весу). Клеточная суспензия бактерий способна катализировать реакцию эпоксидирования пропилена в окись пропилена с выходом 0,12 — 0,2 мг окиси пропилена на 1 мл реакционной смеси в течение 30 мин.

Пример. Выращивание культуры

Rhodococcus erythropoIis ВКПМ S-925 про1752767

Составитель А.Куликова

Техред М,Моргентал Корректор О.Юрковецкая

Редактор В,Петраш

Заказ 2734 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 клеток (концентрацию клеток определяют по ОП при 600 нм), Выход сухих клеток 0,7 г/л культуральной жидкости.

Монооксигеназную активность клеточной суспензии определяют следующим образом. Во флаконы емкостью 10 мл, закрытые резиновыми пробками, вносят 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 мг сухих клеток, приготовленной как описано выше, воздух из флаконов удаляют шприцем и замещают на газовую смесь пропилен (субстрат)+ кислород в объемном соотношении 1:1, Флаконы помещают в термостатированную качалку при температуре 35"С при перемешивании, Через 30, 60, 120 мин флаконы охлаждают, центрифугируют при

5000 об/мин и супернатант наносят на хроматографическую колонку, заполненную порапаком Q. Активность клеточной суспензии выражают в микромолях образовавшейся окиси пропилена в 1 ч на 1 мг сухих клеток или 1 мг клеточного белка, При содержании в 1 мл клеточной суспензии 10 мг сухих клеток в течение 30 мин в 1 мл реакционной

5 смеси обнаружено 0,18 мг окиси пропилена, что соответствует активности 0,62 мкмоль/ч .мг сухих клеток или 2,5 мкмоль/ч.мг клеточного белка.

Таким образом, новый штамм

10 Rhodococcus erythropolls ВКПМ-$-925 при культивировании на питательной среде с пропаном в качестве единственного источника углерода и энергии синтезирует активную эпоксидирующую. монооксигеназу и

15 может быть использован для получения окиси пропилена из пропилена. . Формула изобретения

Штамм бактерий Rhodococcus

20 егуйгороИз ВКПМ $-925 — продуцент эпоксидирующей монооксигеназы.