Питательная среда для выявления сальмонелл

 

Область применения: микробиология, плотная дифференциально-диагностическая среда, выделение сальмонелл. Среда содержит дистиллированную воду, лэкгозу, калий фосфорно-кислый двузамещенный, стерильную желчь крупного рогатого скота, питательный агар, сахарозу, трифенилтетразолиум хлористый и малахитовый зеленый при следующем соотношении ингредиентов, мае. %: питательный агар 3,9-4,5; калий фосфорно-кислый двузамещенный 0,25- 0,35; лактоза 1,00-2,0; сахароза 1,00-2,0; стерильную желчь крупного рогатого скота 5,0-15,0; малахитовый зеленый 0,0025- 0,0035; трифенилтетразолиум хлористый 0,002-0,004; дистиллированная вода остальное . Среда обладает более высокими селективными свойствами по отношению к сальмонеллам, чем известные среды, обеспечивает визуальное отличие колоний сальмонелл от культур, ферментирующих лактозу и сахарозу 2 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ И СТИЧ Е С К ИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 Q 1/10

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.1

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4906021/13 (22) 17.12.90 (46) 30,08.92. Бюл. N. 32 (71) Научно-производственное объединение птицеперерабатывающей промышленности

"Комплекс" (72) С,С. Козак и А.А. Гусев (56) Лабинская А,С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.;

Медицина, 1978, с. 363, СТ, СЭВ 52.09-85, Продукты питания, Метод определения бактерий рода сальмонелла; M., из-во стандартов, 1985, Загаевский И.С. Ускоренный метод обнаружения микрофлбры в говядине и свинине. — Мясная индустрия СССР, 1984, N 1, с, 34. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ

Изобретение относится к микробиоло гии, а именно к плотным дифференциальнодиагностическим средам, используемым для выделения сальмонелл, Существующие дифференциально-диагностические среды обладают недостаточными селективными свойствами по отношению к сальмонеллам. Имеющиеся в практике среды дают неплохйе результаты при работе с чйстыми культурами, В процессе работы при выделении сальмонелл, как правило, приходится работать со смешанными культурами. При росте различных микроорганизмов на этих средах (Эндо, Левина, Плоскирева) культуры трудно дифференцируются,,„,ДЦÄÄ 1758076 А1

2 (57) Область применения: микробиология, плотная дифференциально-диагностическая среда, выделение сальмонелл, Среда содержит дистиллированную воду, лактозу, калий .фосфорйо-кислый двузамещенный, стерильную желчь крупного рогатого скота, питательн ый ага р, сахарозу, трифенилтетразолиум хлористый и малахитовый зеленый при следующем соотношении ингредиентов, мас. %: питательный агар 3,9 — 4,5; калий фосфорно-кислый двузамещенный 0,250,35; лактоза 1;00 — 2,0; сахароза 1,00 — 2,0; стерильную желчь крупного рогатого скота

5,0 — 15,0; малахитовый зеленый 0,00250,0035; трифенилтетразолиум хлористый

0,002-0,004; дистиллированная вода ос.. тальное. Среда обладает более высокими селективными свойствами по отношению к сальмонеллам, чем известные среды, обеспечивает визуальное отличие колоний сальмонелл от культур, ферментирующих лактозу и сахарозу. 2 табл, Состав среды Левина, мас,%:

Лактоза ..: ., 2,0

Метиленовый синий 0,01. «4

Эозий желтый 0,03

Калий фосфорно-кислый двузамещенный 0,2

Питателана1и агар Остальное 3 »

Сальмонеллы на этой среде растут в виде прозрачных, бесцветных или слаборозового оттенка колоний. Ешерихии образуют синие или черные колонйи, протей — оранжевого оттенка колонии. Смесь этих культур трудно дифференцируются. Кроме того, недостатком среды является низкая селективность недостаточно задерживается рост посторонней микрофлоры.

1758076

Известна селективная среда висмут — тиллированная вода, дополнительно содерсульфитный агар состава, мас. %: жит сахарозу, а в качестве индикатора—

Мясной экстракт 0,5 трифенилтетразолиум хлористый и малахиПептон 1,0 товый зеленый при следующем соотношеГлюкоза 0,5 5 нии компонентов, мас,%;

Натрий фосфорно-кислый . Питательный агар 3,9-4,5 двузамещенный 0,4 Калий фосфорно-кислый

Сульфат железа 0,3 двузамещенный 0,25-0,35

Сульфат висмута 0,8: . Лактоза 1,0 — 2,0

Бриллиантовый зеленый 0,0025 10 Сахароза 1,0 — 2,0

Агар . - ---- - "- 2,0 - Стерильная желчь крупВода ....,, .:,„; ., Остальное ного рогатого скота 5,0-15,0

Среда, разлитая в чашки Петри, хранит - Малахитовый зеленый 0,0025 — 0,0035 ся при 4+2 С и используется не ранее 24ч и Трифенилтетразолиум

:. не позже 5 дн.. 15 хлористый 0,002-0,004

Недостатком этой среды является то, что Дистилированная не все виды сальмонелл дают на ней харак- вода... Остальное терные колойии черного цвета с металличе- Сопоставительный анализ предложенс ком блеском и почернение среды под ного состава среды с известной средой(проколониями, В то же время отдельные куль- 20 тотипом) показывает, что предложенный . туры, не относящиеся к роду сальмонелла, состав отличается введением в него в качедают колонии на этой среде, схожие с коло-. стве индикатора трифенилтетразолиума ниями сальмонелл, Кроме того, протей рас- хлористого и спиртового раствора малахитет в Н-форме,: .. тового зеленого, а также сахарозы, Наиболее близкой к изобретению явля- 25 Для экспериментальной проверки ется среда РЖ-65 следующего состава, предлагаемого состава были приготовлемас.%:....; .:: . ны пять смесей ингредиентов, три из котоЛактоза. 2,0 рых показали оптимальные результаты (см.

Калйй фосфорно-кйслый ..: .. табл, 1), двузамещенный 0,3 .30 В состав пяти вариантов сред входили

Стерильная желчь круп- : . соответственно, в мас. %: ного рогатого скота 10,0...., ::.: . I II III IV Ч..

Г1итательный агар 5,0 . Питательный

Бриллиантовый зеленый 0,002 " - агар 3,8 3,9 4,0 4.5 5,0

Дистиллированная:., 35 Калий фосфорновода Остальное кислый двузамеСреда разливается в пробирки. Иссле-, щенный .. 0,1 0,25 0,3 0,35 0,4 дуемый материал вносится в среду для даль- Лактоза 0,4 1,0 1,5 2,0 3;О нейшей инкубации, При работе с чистыми Сахароза — 0,4 1,0 1,5 2,0 3,0 культурами среда обеспечивает дифферен- 40 Стерильная желчь цировку сальмонелл от кишечной палочки, крупного рогатогО

Однако при смеси этих культур результат скота ...2,0.5,0 10,0 15,020,0 оценки среды затруднен и зависит от коли- Малахитовый чественного соотношения сальмонелл и зеленый - 0,001 0,003 0,01 бактерий групп кишечных палочек, Протей 45 : 0,0025 0,0035 дает аналогичнйе с сальмонеллами измене- Трифенилтетразония среды, При использовании среды в чаш- лиум хлоках Петри колонйи сальмонелл и кишечных . ристый:: 0,001 0,003 0,02 палочек плохо дифференцируются, Оба ви- : . . : : . 0,002 0,004 да растут в виде молочного цвета, мутных 50 ".. Дистиллировай колоний. Протей растет колониями практи-: ., ная вода Ос- Ос- Ос- Ос Осчески одинаковыми с колониями сальмо- .. ... таль-таль-таль-таль-тальнелл.::;: -. -::" ...,: -.. -." ..::: ... . - ное ное ное ное ное

Цель изобретения — улучшение диффе- При приготовлении сред использовали ренцирующих свойств среды. 55 1%-ный спиртовый раствор малахитового

Для достижения указанной цели иэвест- зелейого, 0,4%,-нь и водный раствор трифеная среда, в состав которой входит ййта- нилтетразолиума хлористого, калий фостельный агар, калий фосфорно-кислый форно-кислый двузамещенный, лактозу, двузамещенный,лактоза, стерильная желчь сахарозу, желчь крупного рогатого скота, крупного рогатого скота, индикатор и дис- 1%-ный спиртовый раствор. малахитового

1758076 зеленого, питательный агар. Ингредиенты растворяли последовательно после полного растворения предыдущего при подогреве, доводили до кипения, Автоклавировали под текучим паром (100 С) 15 мин; Цвет среды после автоклавирования зеленый. Посевы инкубировали при 37+1 С 24-48 ч, рН среды после автоклавирования находится в пределах 7,0 — 7,2.

В табл. 2 представлены данные о характере роста бактериальных культур на испы10 туемых вариантах сред

Бактериальные культуры использовались после оживления — четырехкратного ежесуточного пассажирования на мясопептонном бульоне, В качестве примера роста лактозоферментирующих микроорганизмов использовали Е, соП 675, в качестве примера роста сахарозоферменти рующих микроорганизмов — Proteus vulgaris.

Рост культур проявляется через 16 — 18 ч, 20 но интенсивную окраску колонии приобре тают через 22-26 ч. Нэ всех вариантах сред культуры растут в S-форме, рост культур

Staph, luteus, Micr. lysodeicticus, Вас, cereus, Bac, sudtilis, Staph. aureus, Str;

fecivm полностью задерживается. Свои свойства среда при хранении при комнатной температуре, разлитая в колбы по 200 мл, сохраняет в течение 1,5 мес, разлитой в чашки Петри — 14 дн (срок исследования) 30

Оптимальные результаты получены при использовании 2, 3 и 4 вариантов сред. Колонии протея на этих средах темно-голубого

35 цвета, ровные, блестящие,.влажные, Колонии кишечных палочек голубого цвета, ров: ные, блестящие, влажные. Эти две культуры . не изменяют цвет среды. Колонии сальмонелл коричневые различных оттенков.

В первом варианте среды колонии ки- 45 шечных палочек серые с коричневым или слабым зеленым оттенком, Цвет среды вокруг колоний изменен от светло-зеленого до серо-коричневого, Колонии протея — серые, бледно-голубые, Колонии сальмонелл схо50. жи по цвету и характеру колоний с колониями кишечных палочек, поэтому визуальная дифференциация этих культур затруднена.

Следовательно, содер>кание компонентов в этом варианте среды следует считать запредельным, В 5-м варианте среды происходит значительное угнетение культур, в том числе

Центральная часть колоний S. gallinarum: pullorum может быть окрашена в вишневый

:цвет. Культуры сальмонелл изменяют цвет среды вокруг колоний с зеленого до светлокоричневого. сальмонелл, особенно S. galiinarumpullorum, поэтому содержание компонентов в этом варианте среды следует считать запредельным. ..Оптимальное содержание малахитового зеленого в этих средах находится в пределах 0,0025 — 0,0035 мас.%. При уменьшении концентрации малахитового зеленого ниже 0,0025 мас. % колонии кишечных палочек окрашиваются в серо-коричневый цвет, колонии протея — бледно-.голубой. Это затрудняет вйзуальную дифференцйацию этих культур от колоний сальмонелл. При увеличении концентрации малахитового зеленого больше 0,0035 мас. % происходит значительное угнетение культур, в том числе сальмонелл. Поэтому концентрации малахитового зеленого меньше 0,0025 мас. % и больше 0,0035 мас. % следует считать запредельными, Оптимальное содержание лактозы (1,0-.

2,0 мас.%) обеспечивает голубую окраску кул ьтур, ферм ентирующих л а ктозу. П ри содержании лактозы 0,4 мас.% и ниже колонии кишечных палочек серые с коричневым . оттенком, Это затрудняет визуальную дифференциацию этих культур от колоний сальмонелл, Поэтоглу концентрацию лактозы меньше 1;0 мас, % следует считать запредельным. Увеличение содержания лэктозы более 2,0 мас, % считается нецелесообразным, так как это не приводит к изменению окраски колоний.

Оптимальное содержание сахарозы находится в пределах 1,0 — 2.0 мас.%. который позволяет определить наличие сахарозоферментирующих свойств исследуемых культур и обеспечивает голубую окраску их колоний. При уменьшении сэхарозы меньше 1,0 мас. % колонии протея приобретают более бледно-голубую окраску. Это затрудняет визуальную дифференциацию этих культур от колоний сальмонелл. Поэтому концентрацию сахарозы менее 1,0 Mac. % следует считать запредельной, Увеличение содержания сахарозы более 2,0 мас. % считается нецелесообразным, так как это не приводит к изменению окраски колоний.

Оптимальное содержание трифенилтетразолиума хлористого находится в пределах

0,002-0,004 мас.%, который обеспечивает окраску колоний сальмонелл в коричневый цвет. Уменьшение содержания трифенилтетразолиума хлористого ниже 0;002 мас. % приводит к более бледной окраске колоний сальмонелл, которая все больше приобретает Серый цвет и теряет коричневый оттенок, Увеличение содержания трифенилтетразо-. лиума хлористого более 0,004 мэс, % приво- .

1758076

7 дит к значительному ингибированию культур, особенно S. gallinarum-pollorum, Следовательно, концентрации трифенилтетразолиума хлористого меньше 0,002 и больше 0,004 мас. являются запредельными, 5

Оптимальное содержание питательного агара 3,9-4,5 мас. %, При уменьшении содержания ниже 3,9 мас. среда получается недостаточно плотной, что создает определейное неудобство при посеве исследуемо- 10

ro материала. Увеличение содержания питательного агара более 4,5 мас. % приводит к получению очень плотной среды. Это требует большего времени при разогреве среды и увеличивает риск разложения угле- 15 родов при нагревании. Поэтому концентрации питательного агара меньше 3,9 и более

4,5 мас. % являются запредельными.

Оптимальное содержание калия фосфорно-кислого двузамещенного находится 20 в пределах 0,25-0,35 мас, %. При уменьшении его содержания менее 0,25 мас. % про. исходит уменьшение буферности среды.

При увеличении содержания калия фосфорно-кислого двузамещенного более 0,35 мас. 25

% изменений в окраске и характере роста колоний не происходит. Поэтому концент рации калия фосфорно-кислого двузамещенного меньше 0,25 и более 0,35 мас. являются запредельными.. 30

Оптимальное содержание стерильной желчи крупного рогатого скота находится в пределах 5,0-15,0 мас. %. Уменьшение со.держания стерильной желчи крупного рогатого скота меньше 5,0 мас. % приводит к 35 уменьшению ингибиторных свойств среды . по отношению к другим микроорганизмам.

Увеличение содержания стерильной желчи крупного рогатого скота с 15,0 до 20,0 мас:% . приводит к увеличению ингибиторных 40 свойств среды и задержке роста S., 9айпагцв-pollorum. Поэтому концентрации стерильной желчи крупного рогатого скота меньше 5,0 и более 15,0 мас. являются запредельными.. 45

Ъ ) Рост культур сальмонелл, кишечных палочек, протея проявляется через 16-18 ч.

Интенсивную окраску колонии приобретают через 22 — 26 ч, Колонии сальмонелл имеют коричневую окраску, колонии Е. coll, Proteus vulgarls голубые, возможен зеле- . ный оттенок. Рост других микроорганизмов (Staph, aureus Лос., Staph. aureus 100, Str, fecium, Вас, luteus, Micr, lysodeicticus, Вас.

subtiiis, Вас, cereus) полностью задержива- . ется (посевы инкубировались при 37+1 С в течение 72 ч).

Возможно применение среды путем прямого посева исследуемого материала без предварительного посева на жидкие селективные среды накопления. Это позволяет сократить сроки исследования на сальмонеллы с 5-ти до 3-х суток, Формула изобретения

Питательная среда для выявления сальмонелл, содержащая питательный агар, калий фосфорно-кислый двузамещенный, лактозу, стерильную желчь крупного рогатого скота, индикатор и дистиллированную воду, отличающаяся тем,что,сцелью улучшения дифференцирующих свойств среды, она дополнительно содержит сахарозу, а в качестве индикатора — трифенилтетразолиум хлористый и малахитовый . зеленый при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Питательный агар 3,9 — 4.5

Калий фосфорно-кислый .. двузамещенный 0,25-0,35

Лактоза . 1,00 — 2,00

Сахароза 1,00-2,00

Стерильная желчь крупного рогатого. скота 5,0-15,0

Малахитовый зеленый 0.0025-0,0035

Трифейилтетразолиум хлористый 0,002-0,004

Дистиллированная вода Остальное

1758076

Таблица. 1

Состав испытуемых вариантов среды

Таблица2

Характер роста культур на испытуемых взрнантзх сред

1 2

ФГ среды

1 3 ) 4

° 1 и

S.typhftaurfusI

S.dublin н

° 1 и

° t

° !

Фон среды эелсный, колонии блестлщне ° округлмс, впамныв. коричневме,лолуПООЗРЗЧНМЕ,ВОКРУГ копаний среда приобретает кори ьчевмй оттенок, S. clo1ere suis

Фан среды темно-зеленый; колонии бпсстяььие, округлые, влащwe, êopnñícsuå, po" сннчзтые, llonynpo- зрачнме. "

S.Sa111пвтащ рц11аппь

S.coli 625

CO!I СРЕДМ ЗЕЛСНЫМ, колонки блестящие, ОКРУГпыеФвгlакиме мутные,poawe,росинчатме с голубим оттенкон.

Фон среды эеленыд копании блестящие, окауглые,влахные, " мутные,ровные,голубые, с более аркин голубыи цент

РОН, Фон среди Зеленмй, колонии блестящие, OtIPyrnue ВпэннМЕ, путные, ровные; голу бые, с более интенсивно окрамеяныи центром, Фон соедм зеленмй, колонии блестящие, округ!в!в,алм«ные, мутные,рбвь!ме,голубнс с более лркнн голубым центром.

Фон среды зеленый, копь!!ин блестящие, Округлые, влвмные, мутные, ровные; голу бые, ра анапе си о окращснные.

Фоч среды зсленмй, Фой среды тенноKonoHNN блестящие, зеленый, колонии округтььеьаламныеj " "блестящие,округлые, мутные;ровные, теи алавмме,бледно-гоно-голубые, рвано- лубые с снневатьм нерио окращенные. оттенкон.

Prot.vu1Sarfs

Зс,ацсецз Пэс, .Зс.aureus 100 лет роста

Нет роста

Яет роста.

:То ме

:Нет роста

То ще н

Нет роста

То ще

То ме «И

ФI н

Staph.luteus

Н1ст. lisodcic«

ticus

1 ° н н

° l и

«и н

Stt.iecfus

Вас. зцЬс ь11в

Ввс. сетемз и и« и

° Ф

° 1

Культура

--"- -- — -" Г"

1 2

S.enteritidis Фон оралы светло" зеленый, колонии . блестящие,мутные, округлме,ровнме вламнме,сеетлэкори Фнеемс с бо лее тсннмм цент» дон е виде то хи.

Цвет среды вокруг колоний нэменяетсл по светло-ко" ричнеааго

Фон среды зелснмд, колонии блестя- щие, округлые, влажные,серые с корнчневмн от тен кон; вокруг коло- ний цвет соедм .. изменен да саетлакоричнееого.

Фа!1 средм зеленый, колонии блестящие, округлые,яланнме, лутнмс, роги!не, се рые со слабым зеленын нгм светла ко ричнеамн оттенкьмь..

В местах густого раста копоний среда светло-коричневая. .

Фон среды зеленый, колонии блестящие, окру лыс,влзмнмс, мутные,равные, серые с зелено-гопубын оттенком, с центром грлзногоъубаго цвета, Фон среды зелени!,капо!я!и блес тящие, путные, акрутгме, роение, аланные,коричне-. вые,центр колоний не выращен. Цвет среды вокруг колоний изменен до светло-коричне аого

Фон средм зеленый, колонии бпестяузье, округлые,алак!Фые, коричневые,попупроз ра чине, вокруг копоний просветление средм со светло-корнчиеамн оттенком

Фон среди зеленый, колонии блестящие, Ькруглые,влэмные, путные,равнме,голубые серо-голу" быс, со слабо аы- рвяенныи центром грязно-голубого цвета.

Фан средм эелеймй колоним блестящие, путные, округлме, ровные, алак! !ые, коричневые,центр копоний нс вмраксн

Цвет среды вокруг колоний изменяется от зеленого до

cserno-коричмевого

Фон среди зеленьд, колонии блестящие, мутные,округлые, ровные, алавнме," коричневые, цвет . колоний не вмре" мен. Цвет среды

soxpyr колоний нзненяетсл от земно. го до светло-коричневого

Фон среды зеленый, копании блестящие, округnнe,вламные; корнчневмн полу- прозрачные,вонруг колоний среда при

Обретает незначн- .. тельныд каринке емй оттенок.

Фон средм темноэелсный, колонии блестящ е;мутные, округ яме, ровные, впаянна Ф коричневые с (млФФ беэ) темно-внмнеаьвФ центром. Цвет среды вокруг колоний нзненяется с темно-зеленого дО темна posoeoro °