Способ определения розеткообразующей реакции нейтрофилов

 

Использование: предложенное изобретение относится к медицине и может быть использовано, в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофиловых гранулоцитов (НТ). Цель - ускорение и упрощение способа. Сущностью предложения является экспрессметод определения розеткообразующей способности НГ в капиллярной крови, при этом эритроциты разрушают гемолитической жидкостью, а отцентрифугированную взвесь помещают в лунку планшета, фиксируют 0,05 мл 0,6-1 % р-ра глутаральдегида в течение 5-7 мин, а затем фиксацию останавливают встряхиванием планшета, и в препарате-капле выявляют розеткообразующую способность НГ известным способом. 1 табл. Ј

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (я)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Д Еу, й.ii

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4852391/14 (22) 18.07.90 (46) 30.08.92. Бюл. N 32 (71) Кубанский государственный медицинский институт им. Красной Армии (72) И.В.Нестерова, Г.А.Чудилова и Г.Г.Рожкова (56) Дзержинская И.Н. Розеткообразующая ,способность нейтрофилов и Т-лимфоцитов у больных с хронической почечной недостаточностью. Иммунология, 1962, N. 1, с. 64— . 64. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ НИЯ РОЗ ЕТКООБРАЗУЮЩЕИ РЕАКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ (57) Использование: предложенное изобретение относится к медицине и может быть

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофильных гранулоцитов (ГГ), с целью прогнозирования течение различных заболеваний бактериальной, вирусной и аллергической природы, мониторинга иммунного статуса при проведении иммунокоррекции дисфункций Н Г, Целью изобретения является упрощение и ускорение способа. . Способ осуществляют следующим образом.

Подготовка клеток. Забор крови. Кровь получают из безымянного или указательного пальца. Кровь в объеме 0,5 мп самотеком набирак)т в, капилляр, смоченный 2,7 -ным использовано. в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофиловых гранулоцитов (НГ). Цель— ускорение и упрощение способа. Сущностью предложения является экспресс- метод определения розеткообразующей способности НГ в капиллярной крови, при этом эритроциты разрушают гемолитической жидкостью..а отцентрифугированную взвесь помещают в лунку планшета, фиксируют 0,05 мл 0,6 — 10/, р-ра гпутаральдегида в течение 5-7 мин, а затем фиксацию останавливают встряхиванием планшета, и в препарате-капле выявляют розеткообразующую способность НГ известным способом.

1 табл. раствором ЭДТА. Кровь помещают в стеклянную центрифужную пробирку, смоченную ЭДТА той же концентрации из расчета

10:1.

Выделение лейкоцитарной взвеси.

Лейкоцитарную взвесь получают путем лизиса эритроцитов гемопитической жидкостью состава: 0,083 -ного раствора хлористого аммония +0,04 г/л ЭДТА рН 7,2-7,4. К оставшимся после центрифугирования клеткам крови добавляют 1 мл гемолитической жидкости на 30 с при постоянном помешивании, Затем добавляют 2++5 мл среды 199 для прекращения действия гемолитической жидкости на клетки. Центрифугируют 10 мин 1000 06/мин, сливают надосадочную жидкость. осадок осторожно встряхивают, К полученному осадку клеток

1758556

Показатели

Прототип

3 — 5мл

Кровь венозная

0,1 мл

Расход крови

0,5

Кровь капилярная

0,05 клеточной суспензии сход реактивов икол верографии глутаральдегид траты времени на овку реакции р ЕРЕН ество обследованных и постановке метода а 1 абочий ень

0.6%

1,30 — 2 ч

32 — 64

8 — 16 добавляют среду 199 в количестве 0,3-0,4 мл. Ресуспендируют, Постановка реакции роэеткообразоваПостановка рЕ-РОН, В лунку планшета наливают 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов, добавляют

0,05 мл 2,5ф,-ный суспензии эритроцитов барана (ЭБ) трижды отмытых физраство-!, о ром. Инкубируют в течение 5 мин при 4 С.

Цеитрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования в лунки осторожно, чтобы не взболтать осадок, добавляют 0,05 мл 0,6 — 1%-ный раствор глутаральдегида. Выдерживают при комнатной температуре 5-7 мин. После этого надоса.дочную жидкость удаляют одновременно из двух лунок планшета быстрым интенсивным встряхиванием. Затем в лунки заливают по

0,1 мл физраствора или среды 199. Осадок тщательно ресуспендируют и готовят препарат-каплю.

Постановка пЕ-РОН..

В лунку планшета заливают 0,05 мл лейкоцитарной суспенэии, добавляют 0,05 мл

2,5 -ной суспенэии Э Б. Планшет инкубируют 20 мин при 4 С. Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, Далее следует повторная инкубация 60 мин при 4"С. Затем фиксируют 0,05 мл 0,6-1%-ным раствором глутаральдегида в течение 4-7 мин.

Останавливают фиксацию интенсивным встряхиванием планшета, Добавляют0,1 мл среды 199. ресуспендируют. Готовя1 препарат-каплю.

Подсчет розеткообразующих клеток.

Высушенные мазки фиксируют в метаноле в течение 10 мин окрашивают раствором азур-зозин рН 6-6 (по Романовскому) в течение 5 мин, Ополаскивают водой, сушат на воздухе, подсчитывают количество розеткообразующих нейтрофилов на 100 нейтрофилОв, Способ апробирован на 180 работниках

Апшеронского деревообрабатывающего комбината, которым проводился мониторинг иммунного статуса с целью выявления иммунопатологических состояний. При этом параллельно оценилось состояние здоровья

5 работающих и уточнялись клинические признаки иммунодефицита. Установлено, что у

15.46% рабочих имеется дефицит рЕ-РОН, у 5,0 — поздних Е-РОН; гиперфункция НГ обнаружена по рЕ-POH у 28,12 обследован10 ных лиц, по пЕ-РОН вЂ” у 52,48%, Выявленные дисфункции рецепторного аппарата в

87.5% случаев совпали с клинически выявленными признаками иммунопатологических состояний, которые выражались в

15 наличии хронической бактериальной инфекции, персистирующей вирусной инфекции (лица длительно и часто болеющие), аллергическими и аутоиммунными процессами.

Преимущества предлагаемого способа

20 .представлены в таблице.

Таким образом. имеется явное преимущество при использовании предлагаемого экспресс-микрометода при массовых эпидемиологических обследованиях и проведе25 нии мониторного иммунного статуса у лиц с вторичным ИДС, находящихся на иммунокоррекции.

Формула изобретения

Способ определения розеткообразую30 щей реакции нейтрофилов, включающий выделение лейкоцитов из крови, инкубацию с эритроцитами барана, фиксацию глутаровым альдегидом. Остановку фиксации и подсчет розеток в ранней и поздней

35 субпопуляциях нейтрофилов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, выделение лейкоцитов осуществляют с помощью гемолиэа эритроцитов растворов хлористого аммония из

40 микрообаемов крови, инкубацию с эритроцитами барана ведут в лунках планшета, фиксируют 0,6-1 -ным раствором глутарового.альдегида в течение 5-7 мин, далее удаляют фиксатор встряхиванием планше45 та.

Предлагаемый экспрессмето