Способ определения количества живых клеток микроорганизмов

 

Использование: медицина, биотехнология , охрана окружающей среды. Сущность изобретения: в исследуемую пробу, зараженную различными видами микроорганизмов, вводят одновременно два или более флуорогенных субстрата. Выбор субстратов зависит от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе. Измеряют суммарную величину флуоресценции. При этой величине определяют количество живых клеток микроорганизмов в исследуемой пробе.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ И СТИЧ ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

П9) (1() (51) 5 С 12 q 1/04

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .

Н А ВТОРСКОМЪ/ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4898201/13 (22) 02.01.91 (46) 30.11.92. Бюл. (: 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборо-,. строения (72) С.В.Газенко, 10.Ф.Давыдов и . и Л.В.Вавилова (56) Glebowski I. Interaction of fluorogenic substances with viab1е and

heat-Killed cells of microorganisms//

//Acta U.L. Folia biochim А biophys., 1986, N 5, р. 127-130.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для быстрого определения микроколи честв жи вых клеток в смеся x состоящих из микроорганизмов различных видов, родов и семейств,в медицинской микробиологии, биотехнологии и охране окружающем среды.

Цель изобретения - повышение чувствительности, достоверности способа и определение количества живых клеток микроорганизмов в смесях.

Способ включает введение в исследуемую пробу одновременно два или более флуорогенных субстрата в зависимости от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе, инкубирование пробы, измерение суммарной . величины флуоресценции и определение по ней количества живых клеток микроорганизмов.

Смесь флуорогенных субстратов позволя ет выя вит ь жи вые клет ки даже в (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

ЖИВЫХ КЛЕТОК ИИКРООРГАНИЗМО8 (57) Использование: медицина, биотехнология, охрана окружающей среды.

Сущность изобретения: в исследуемую пробу, зараженную различными видами микроорганизмов, вводят одновременно два или более флуорогенных субстрата.

Выбор субстратов зависит от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе. Измеряют суммарную величину флуоресценции. При этой величине определяют количество живых клеток микроорганизмов в исследуемой пробе. том слУчае, когда они не обладают фер- . ментами для расщепления какого-либо из используемых флуорогенных субстратов.

Ф

Пример 1. К 3 мл смеси клеток L .coli И-17 и Pseudomonas auran—

tica,приготовленной на дистиллированной воде. добавляют О, 1 мл раствора

4-метилумбеллиферилфосфата (0,1 мг/мл ©ф в этаноле) и 0,1 мл раствора 4-мети- д лумбеллиферилбутирата (О, 1 иг/мл в (р ,этаноле) . К другим 3 мл такой же сме- 0 си клеток, предварительно прогретой до 100 С (1 минута) и охлажденной до комнатной температуры, добавляют аналогичные количества 4-метилумбеллифе рилфосфата и 4-метилумбеллиферилбутирата. Обе пробирки помещают в водяную баню при t = 40 С на 15 мин. После этого пробы быстро охлажают до 0

-6 С и флуориметрируют. Длина волны возбуждения флуориметра устанавлива, ется на 320 нм, длина волны флуорес1 77818У ценции 452 нм. Из величины флуоресценции первой пробы вычитают величину флуоресценции второй пробы (фоновой флуоресценции}. Полуценная величина соответствует истинному колицеству,

Рseudor>onas aurantica не onределяются. В случае использования только

4-метилумбеллиферилацетата определяются только клетки Pseudomonas аигас- 1са но не Е.coli. Таким образом, ис-. тинное количество живых клеток, в данной суспензии можно определить только смесью двух соответствующих флуорогенных субстратов.

П р и и е р ?. Производство кор.мового белка осуществляют на основе одного из видов рода Candida. Однако в процессе ферментации в среде обнаруживают большое количество клеток

СапйЫа других видов. После стадии плазмолиза необходимо выявить общее количество живых клеток в продукте..

Наибольшие активности клеток рода

Сап<1Ыа — эстераэн*я и липазная. Они наилучшим образом выявляются с помощью 4-метилумбеллифорилацетата (4ИУА) и 4-метилумбеллиферилбутирата (4-!1УБ).

Однако они гидролизуются различными видами рода Caiidida неодинаково, например

4-ИУА 4-ИУБ.

Candida 1р.1 55 70

Candida 1р. 2 8 4

Candida 1р.3 28 12

Candida 1р.4 26 26

Candida 1р. 5 21 66

Следова< ельно, наиболее достоверно количество клеток живых можно определить с помощью смеси 4-ИУА и 4-<1УБ.

С этой целью готовят две пробирки плазмолизированной взвеси по 3 мл

«аждая. Одну из них (контрольная) прогревают 10 мин на кипящей водяной 50 бане. Затем, к каждой добавляют по

О,! мл. фосфатного буфера с рН 5,4 и по 0,1 мл 4-МУА и 4-ИУБ с концентрацией 0,1 мг/мл этанола. Пробы инкубируют ч при 37 С. Затем к каждой 55 пробирке добавляют 6 мл 1/15 молярного раствора Г!а НРО, . Далее пробы центрифугируют 10 минут при

8000 об/мин. Надосадочные жидкости флуоримет ри руют (% z»<; — — 366 нм и

= 452 нм) . Из величины флуоресценции первой пробы вычитают величину флуоресценции контрольной пробы.

Полученное значение флуоресценции соответствует количеству живых клеток в исследуемом образце. Таким образом могут быть выявлены концентрации живых клеток вплоть до !03 кл/мл.

Предлагаемый способ определения живых клеток микроорганизмов отлича ется высокой чувствительностью, экспресностью и достоверностью определения.

Способ может найти применение для контроля качества пастерилизации, плазмолиза, стерилизации продукции или производственных емкостей в медицинской, микробиологической и пищевой промышленности, так как позволяет достоверно определять исключительно малые количества выживших микроорганизмов и достаточно полно определить общее количество живых клеток всех видов и родов микроорганизмов, находящихся на обрабатываемых объектах.

Экспрессное, чувствительное и достоверное определение общего количества живых клеток микроорганизмов имеет большое значение для оперативного принятия соответствующих мер. формула изобретения

Р O

Способ определения количества живых клеток микроорганизмов, включающий введение в исследуемую пробу флуорогенного субстрата, инкубирование смеси, измерение величины флуоресценции и определение по ней количества живых клеток микроорганизмов, о т л и ч а ю щ и " с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа за счет возможности учета различных аидов микрофлоры в исследуемой пробе, в пробу вводят одновременно два или более флуорогенных субстрата в зависимости от числа видов микроорганизмов, присутствующих в пробе, и измеряют суммарную величину флуоресценции.