Способ идентификации viвriо аlвеnsis

 

Использование: медицинская микробиология , лабораторная диагностика Vibrio albensis. Сущность изобретения: идентификацию Vibrio albensis осуществляют путем совместного инкубирования испытуемой культуры с индикаторным штаммом. В качестве индикаторного штамма используют штамм Vibrio albensis KM-41, инкубирование проводят в течение 20-24 ч, полученную смесь микроорганизмов прогревают при в течение 40-60 мин, затем высевают ее на газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию фаголизиса. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ И СТИЧ ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (g>)s С 12 9 1/04, С 12 N 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4878182/1) (22) 21.09.90 (46) 30.11.92. Бюл. Е 44 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумной институт (72) Т.A.Кудрякова (56) Онацкий И.И., Грижебовский Г.И.

Методические рекомендации по усовершенствова нию идентифи ка ции светящихся вибрионов. НИИ Кавказа и Закавказ ьл, Ставрополь, 1986. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ VIBRIO АТ-. .ВЕМЯТБ (57) Использование: медицинская мик- .

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к лабораторной диагностике Vibrio albensis (синоним V.phosphorescens) .

Светящиеся вибрионы вызывают диарейные заболевания и обнаруживаются не только у больных людей, но и в объектах окружающей среды. Методы диагностики Vibrio albensis разработаны недостаточно. Серологическое типирование не используется из-за отсутствия коммерческих сывороток.

Известен способ идентификации светящихся вибрионов, принцип которого основан на том, что при совместном выращивании с испытуемой на свечение культурой в пробирке с пептонной водой индикаторный штамм V.albensis индуцирует свечение испытуемого штамма.

Однако этот способ основан на выявлениии и ндуци рова нной биолюми несценции, являющейся непостоянным признаком. Свечение индикатора-индуктора зависит от качества и состава питательной среды, сроков хранения, температуры и времени культивирования, а также симбиотических реакций или реакций ингибиции в смешанных культурах. Отсутствие критериев отбора 4 штамма-индуктора, подбор определенных с концентраций культур в смесях, инди- i QQ видуальные особенности адаптации зре- . а ,ния и восприятия интенсивности свече- гс ! лг ния затрудняют идентификацию светя-, у р щихся вибрионов. Применение известного способа создает сложности при ис-. следовании большого количества штаммов, утративших биолюминесценцию R процессе длительного хранения.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Это достигается тем, что к клеточной суспензии Фагочувствительного ин. дикаторного штамма светящихся вибриоГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) „„5U „„1778 l 88 А1 робиология, лабораторная диагностика

Vibrio albensis. Сущность изобретения: идентификацию ИЪг1о а1Ьепз з осуцествляют путем совместного инкубирования испытуемой культуры с индикаторным ытаммом. В качестве индикаторного штамма используют штамм Vibrio albensis КИ-41, инкубирование проводят в течение 20-24 ч, полученную смесь микроорганизмов прогревают при 55-57 С в течение 40-60 мин, затем высевают ее на газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию фаголизиса. 1 табл.

i 778188 нов засев-.гют идентифицируемый штамм

V, !! Ьеп;18 и через 20-24 часа инкубации пр«37" реакционную смесь культур прогревают при >5-57 . Прогретую

5 навес - «нактивированных клеток наносят на газон индикаторного штамма е виде дорожки. Учет резулЬтатов проводят по появлению зоны лизиса фагом спустя 20-24 часа вырацивания при 37;1п

Продукцию Фага выявляют при посеве испытуемых штаммоз с индикаторной, культурой V. a lb".ns is 1193С, депонированной в Музее микроорганизмов института "Микроб по номером KH-4 1 (1193С). На газоне штамма КМ-41 (1193Ñ) Фаги V.аlbensis формируют прозрачные и мутные зоны лизиса. В качестве индикаторного штамма может быть использована любая нелизогенная

Фагочувствительная культура V,albensis. Тест-штамм 7.albensis 1193С является универсально фагочувствительHbIM, поэтому был выбран нами из 11 фагочувствительных штаммов. Штамм 25

KN-41 (1193С) по большинству морфологических и физиологических характеристик соответствует микроорганизмам вида Vibrio albensis. культурально-морфологические приз- gg на <«.

l3 мазках иэ агароаых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки имеют вид грамотрицательных полиморфных палочек.

Подвижные (при выращивании в 0,33 целочном агаре наблюдается помутнение столбика агара) .

Рост на твердых питательных сре-дах: на целочном агаре (рН 7,б-7,8) вибрионы образуют через 18 часов роста при 37 колонии правильной формы, диаметром 1,9 мм с влажной; блестяцей поверхностью, полупрозрачные в проходяцем с вете, голубова тые в отраженном.

Рост на жидких питательных средах:, на щелочном бульоне, содержащем

100 мкг/мл стрептомицина и без антибиотика, дает помутнение без образования пленки,, 50

Биохимическая активность штамма:!

Штамм разлагает глюкозу, сахарозу, манн«т с образованием кислоты без газа, Не расцепляет маннозу и арабиназу.

Декарбоксилирует лизин, не расщепляеr арг«нин, не образует сероводород. Штамм устойчив к 50 мкг/мл полимиксина.

Отношение к гомо- и гетерологичным фагам: штамм не лизируется диагностическими Фагами, классическим холерным и эльтор.

ХЛФ 3 - отр УДФ 4 - отр Х,qф 5- отр

Лизируется фагами, продуцируемыми

V.albensis.

Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам: штамм не агглютинируется О-холерной сnlsopoTKoH и типоспецифическими сыворотками Инаба, Огава.

Антигенные свойства штамма: штамм авирулентный для кроликов-сосунков в дозе 10 кл.

Питательные потребности, flpoToiроф (на среде Ьхаскарана и Роули растет) .

Генетические особенности штамма: является стрептомицинустойчивым фосфоресцирующим мутантом Ч.albensis, Продукт, синтезируемый штаммом: штамм продуцирует фермент люциферазу, обеспечивающую в темноте фосфоресценцию колоний и бульонной культуры.

При посеве в качестве индикаторного с лизогенными штаммами V.albensis выявляет умеренные Фаги.

Активность (продуктивность) штамма: штамм является индикатором для фагов, образуемых лизогенными культурами. При посеве выращенного в бульоне штамма в слое 0,73 агара по Грация, засеянные в виде "дорожки" фаги дают зону Фаголизиса.

Штамм светится в темноте фосфорическим блеском. Выявить свечение мож/ но после адаптации глаз в течение

10 минут. Свен ние выявляется лучше у культуры, выращенной в 11 пептонной воде, в бульоне Мартена ярне в пленке (рН 7,6-7,8) после инкубирования посевов при 37 в течение суток, на агаре Мартена, в полужидком агаре. На плотных средах периферия посевов светится ярче в посевах на секторах наблюдается свечение всего сектора.

Фагочувстнительность штамма определяют по Грациа,при этом вносят

0,5-1 мл 4-часОВОИ бульОннОЙ культуры штамма 1193С в 4 мл 0,7". агара Нартена и выливают на агаровую пластинку, затем на газон культуры наносят в виде "дорожки". каплю Фага. Штамм-индикатор стабильно выявляет фагопродукцию лизогенных штаммов.

8188 б

t 177

Акти в нос . : . I".-> м>лд 1ро веря;; <с я Та к же при посеве О, 5 мп бульонной культуры в 11 мл О, р агара с последующим нанесением на газон индикатора капли надасадочной жидкости,прогретой при

56 40 минут бульонной культуры лизогенного 1увствительнога к стрептамицину штамма-продуцента hara в виде

"дорожки", Способ, условия и состав сред для хранения: штамм в ампулах в лиафили° о зирояаннам состоянии при 4, В полужидком 0,31 щелочном агаре при комнатной температуре, на скошенном агаре в пробирках пр 1 комнатной температуре.

Способ, условия и состав размножения штамма: Гасев микробной взвеси из ампуль1 производится на щелочной агар (рН 7,6-7,8), затем пересевается на щелочной агар.

Условия и состав сред для продукции продуктов жизнедеятельности клеток: выращивали щелочном бульоне, щелочном агаре (pH 7,6-7,8) при 37 в течение 2 часов.

Пример 1. Готовят взвесь двух штаммов V.a)bensis 1193C и V.àl—

bensis 9504: па 1 петле суточных агаровых культур вно-..ÿò В одну пробирку с 2 мл бульона 11артена (pH 7,6-7,8) о и оставляют на 20 часов при 37 . ЗаО тем смесь культур прагревают при 55 в те ение часа и наносят каплю в виде дорожки на га зон штамма U. а1Ьепsis 1193С, предварительно засеянного в слое 0,7> агара на пластинку 1,5Й агара !1<>ртена.

Учет проводят через 24 часа выращивания посевов при 37 : на месте нанесения капли обоазуется зона про" светления газона. Идентифицируемый штамм 9504 относят к Vibrio albensis.

Пример ?. Вгнпалняют аналогично примеру 1, но используют для прогревания смеси кульi-yp V.albensis

1193С и 9504 и температуру 56 С в те- чение 40 минут.

Пример 3. Выполняют как описано в r!pH>Iepe 1, используH смесь двух штаммав Ч.albensis 1193С и 9510. о

Смесь культур прогревают при 57 С в течение 60 мин.

П р и и е р 4. 0,5 мл 4-часовой бульонной культуры нелизогенного штамма V.albensis 2853 вносят в 5 мл

О, 73 агара и засевают двухслойным ме» тодом, 1 ка плю фа гали за та 9504 нано5

Зд

< >-; г;, Вид даражк I »а гаso»

sjs ?853. После инкубиравания посевов при 37" в течение 24-48 часов учитывают рсзультаты. Яана лизиса культуры .определяет принадлежность нели загенного штамма ?853 к Vi!>rin

a1 bensis. ,>1ля осуцест впения такого способа идентификациH было изучено 39 штаммов

1 . albensis (синоним V. р13оз1 Ьаrescens) в группу которых вошли таl<>lie два сератипированных штамма .в1Ьеп is P

9504 (серотип 5), Р-9510 (сератип 6), пре<1пон<енные Гальцевой с соавт. для получения агглютинирующих сывороток светящихся вибрионов.

На основании фаголизиса индикаторного штамма светящихся вибрионов были идентифицированы 15 лизогенных штаммав 7.albensis, три из которых через

4 гада хранения в столбике агара под вазелинавын маслом утратили способность светиться. 12 штаммов V.alÜensis »e содержали в супернатанте фагов, В связи с этим штаммы были проверены на лизабельность, фагами полученными из культур 7.albensis. В таблице представлены результаты повышения лисла идентифицирсванньх штаммав за счет дапалнительнага испытания двух фагав 9504 и 9510. вьделенных по предлагаемому способу из адноименHt,Iõ штаммов (5 и 6 серотипов соотяетст венно) .

11ак Видно из таблиць1 па предла га е<<ому способу иден тифи ци рава но

27 штаммов, па известному способу12, т.е. эффективность лабораторной диагностики повышается более чем в

? раза.

Проведение экспериментов показало, что фаги V.albensis отключаются ат холерных и V.cholerae не 01 группы высокой чувствительностью к хлороформу. Поэтому для инактивации клеток .смешанной культуры используют о прогревание при 55-57 С в течение 4060 минут.

Таким образом, способ повышает эффективность лабораторной диагностики

V.albensis с положительным и отрицательным феноменом свечения. Он может быть использован при работе с большим набором ытаммав V.albensis, неагглютинирующихся холерными cblворот-. ками и сыворотками к НАГ-Вибрионам, Практическую ценность представляет выделение фагов из штаммав V.albensjs

Формула и з о б р е т е н и я

Способ идентификации Vibrio а1Ьепsis путем совместного инкубирования

Количество изученных штаммов

Vibrio а1ben sis

Идентификация светящихся вибрионов по предлагаемому способу по известному способу

Лизис нелиСвечение штаммов + с индуктороминдикатором фагопродукция лизогенными шта мма ми+

+и нди катор зоге нных штаммов фага ми

9504 9510

12

Составитель Т.Кудрякова

Редактор Л.Павлова Техред И.Моргентал Корректор Н.Слободяник

Заказ 4165 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

7 17

9504 и 9510 известных серотипов (5 и

6 серовары), что обеспечивает получение диагностических препаратов фагов светящихся вибрионов, Использование препаратов Фагов 9504 и 9510 позволяет идентифицировать нелизогенные штаммы V.albensis, что улучшает лабораторную диагностику светящихся вибрионов.

78188

8 испытуемой культуры с индикаторным штаммом и учетом результатов, о т личающийся тем, что, с це5 лью повышения достоверности способа, в качестве индикаторного штамма используют штамм Vibrio albensis КМ-41, инкубирование проводят в течение 2024 ч, полученную смесь микрооргани з10 мов прогревают при 55-57 С в течение

40-60 мин, затем высевают ее íà газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию фаголизиса.