Способ получения эндо-n-ацетилмурамидазы и комплекса лизирующих ферментов

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: для культивирования продуцента используют среду, содержащую (%) кукурузный экстракт 0,8-1,2; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза 0,4-0,6 (дробная подача ); аммоний сернокислый 0,3-0,4; мел технический 0,4-0,5; крахмал картофельный 0,5-0,6; рН 7,4-7,8. Выращивание Streptomyces levoris проводят глубинным способом при 26-28°С в течение 56-70 ч с последующим выделением ферментов. При использовании способа упрощается выделение эндо-М-ацетилмурамидззы, увеличивается выход ферментных препаратов: эндо- М-ацетилмурамидазы в 15-17 раз, а комплекса лизирующих ферментов - 4-5 раз. Соответственно в 3-4 раза и 8-10 раз увеличивается удельная литическая активность указанных препаратов. сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 9/36, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4854360/13 (22) 24.07.90 (46) 15.12.92. Бюл. М 46 (71) Институт микробиологии АЙ СССР и Московская медицинская академия им, Сеченова (72) В. Д. Кузнецов, 3. Ф. Шмакова и Н. И.

Брико (56) Шмакова 3. Ф. и др. Литические ферменты, продуцируемые Actlnomyces levoris.

Микробиология, 1986, т. 47, с, 479-484. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДО-N-АЦЕТИЛМУРАМИДАЗЫ И КОМПЛЕКСА ЛИЗИРУОЩИХ ФЕРМЕНТОВ (51) Использование: биотехнология, Сущность изобретения: для культивирования

Изобретение относится к биохимии и ферментной промышленности, а именно к способу получения эндо-N-ацетилмурамидазы и комплекса ферментов, лизирующих клетки бактерий, включая гемолитический стрептококк группы А.

Наиболее близким к предлагаемому яв ляется способ получения энда-N-ацетилмурамидаэы и комплекса лизирующих ферментов с использованием актиномицета — продуцента — Stneptomyces Ievorls npu выращивании на ййтательной среде, содержащей гидролизат казеина фирмы 0Нсо (1).

Недостатком данного способа является невысокий выход ферментов и использование в питательной среде дорогостоящего ком- понента — гидролизата казеина фирмы

0ifco, приобретаемого за валюту, „„Я2„„1781296 А1 продуцента используют среду, содержащую ($) кукурузный экстракт 0,8 — 1,2; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза 0,4-0,6 (дробная подача); аммоний сернокислый 0,3 — 0,4; мел технический 0,4 — 0,5; крахмал картофельный

0,5 — 0,6; рН 7,4-7,8. Выращивание

Streptomyces levorls проводят глубинным способом при 26 — 28 С в течение 56 — 70 ч с последующим выделением ферментов. При использовании способа упрощается выделение андо-N-ацетилмурамидазы, увеличивается выход ферментных препаратов: эндо-N-ацетилмурамидазы в 15-17 раз, а комплекса лизирующих ферментов — 4 — 5 раз, Соответственно в 3 — 4 раза и 8-10 раз увеличивается .удельная литическая активность указанных препаратов.

Целью настоящего изобретения являет- 4 ся повышение выхода -энда-N-ацетилмура- QQ мидазы с одновременйым исключением из — а питательной среды гидролиэата казеина ) фирмы Difco. 0

Цель достигается тем, что продуцент

S,levorls выращивают глубинным способом при температуре 26-28 в течение 56 — 70 часов после инокуляций колб 2-суточным вегетатйвным мицелием в количестве 5 об. на ферментационной среде, содержащей ($): кукурузный экстракт — О,& — 1,2 (по сырому весу), натрий хлористый — 0,4 — 0,6; глюкоза — по 0,2 и 0,05 через каждые 20 — 24 часа. ферментации; аммоний сернокислый — 0,30,4; мел технический -0,4 — 0,5", крахмал картофельный — 0,5-0,6, рН среды 7.4 —.7,8 (доводится 0,1 N NaOH). При этом достига1781296 ется повышение выхода и удельной активности целевых продуктов. Из 50 л культуральной жидкости получают 1814 мг препарата эндо-ацетилмурамидазы с удельной литической активностью 580 Еlмг белка 5 и 2350 мг препарата, содержащего комплекс лизирующих ферментов с удельной литической и и ротеолитической активностью850 Е/мг белка и 1130 Е/мг белка соответственно 10

Внесение в ферментационную среду кукурузного экстракта ниже 0,8 приводит к замедлению накопления биомассы продуцента и, как следствие, удлинению. процесса ферментации. Увеличение в среде 15 кукурузного экстракта выше 1,2 не приводит к увеличению выхода ферментов. Снижение койцентрации хлористого натрия ниже 0.4% и увеличение его концентрации выше 0,6% приводит к появлению крупно- 20 зернистых микроколоний, удельная активность которых ниже по сравнению с нормальными хлопьеобразными микроколониями. При добавлении в среду аммония сернокислого ниже 0,3% не обеспечивает 25

"дост!ггочного азотного питанйя продуцента, а увеличение ее выше 0,4% не отражается на росте и активности продуцента. Снижение концентрации мела техйического ниже

0,4% не обеспечивает в полной мере есте- 30 ственную регуляцию рН среды. а повышение ее свыше 0,5% ингибирует активность фермента. При снижении койцентрации крахмала картофельного ниже 0.4% наблюдается уменьшение выхода биомассы, а при 35 увеличении концентрации крахмала выше

0,6, часть его остается йеиспользованной продуцентом. Наконец, дробная подача глюкозы по 0,2 через каждые сутки ферментации предотвращает катаболитную ре- 40 прессию синтеза ферментов, что сйособствует -максимальному накоплению последних в культуральной жйдкостй.

Таким образом; отличительными признаками данного способа является то, что 45 культивирование проводят на питательной среде следующего состава (%): кукурузный экстракт — 0,8-1,0 (по сырому весу); натрий хлористый — 0,4-0,6; глюкоза — 0,4-0,6 (по

0,2 каждые сутки); аммоний сернокислый — 50

0,3--0,4; мел технический — 0,4-0,5; крахмал картофельный — 05-0,6; при рН 7,4-7,8 в течение 56-70 ч с йоследующим выделением ферментов.

Пример 1. Культуру S.låvîrlç 96 55 выращивают в 20 конических колбах емкостью 1000 мл, заполненных 250 мл жидкой ферментационной среды следующего состава (%): кукурузный экстракт — 0,8 натрий хлористый — 0,4; сульфат аммония — 0,3; технический мел — 0,4; картофельный крахмал — 0 5, глюкоза — 0,2 и по ходу ферментации вносятся через каждые 24 часа по 0,2%; рН среды 7,8; стерилизация при 0,8 атм 30 мин. Колбы инокулируют 5% (по объему) двухсуточного вегетативного мицелия

levoils 96, выращенного на той же среде глубинным способом, Ферментацию ведут на круговой качалке, скорость вращения которой составляет 220 об/мин, при температуре 26 С в течение 70 часов; При этом каждые сутки вносят по 2 г/л глюкозы в процессе ферментации — до 6 г/л. Полученную культуральную жидкость освобождают от мицелия центрифугированием (7000 g, 15 мин, 4 ). Из полученного нативного раствора осаждают ферменты сульфатом аммония при насыщения 70% в течение 10 часов при

4 . Осадок собирают на центрифуге Heraeus сйг!зс(100009, 10 мин,4 ), растворяют в 100 мл 0,002 М калийфосфатного буфера рН 8,0 и обессоливают гельфильтрацией на колонке (3,5 х l00 см), заполненной сефадексом

Г-25 (грубый). Затем раствор ферментов наносят на колонку (3,5 х 60 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,002 M калийфосфатным буфером, рН 8,0. Элюцию проводят тем же буфером со скоростью 30 мл/ч, Получают фракцию, которая не сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе. и наносят ее на колонку (3,0 х 60 см) с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером. Элюцию проводят со скоростью 20 мл/ч. Белок, элюированный с колонки исходным буфером (0,002

М), представляет собой комплекс литических ферментов с удельной литической активностью 750 Е/мг белка (за единицу активности принимают изменение оптической плотности суспензии клеточных стенок стрептококка группы А тиг 29М при длине волны 650 нм на 0,001 на 1 минуту при температуре 37О) и с удельной протеолити- ческой активностью 1200 Еlмг белка (за единицу активности принимают изменение . оптической плотности 0 5 х 10 М раствора

Й-бензоил-L-аргинин этилового эфира при длине волны 253 нм на 0,001 на 1 минуту при температуре 37О). Перед элюцией фермента эндо-N-ацетилмурамидазы колонку промывают 0,04 М калий-фосфатным буфером рН

8,0. Белок, элюированный с колонки 0,08 М калий-фосфатным буфером рН 8,0, является эндо-И-ацетилмурамидазой с удельной литической активностью 550 Е/мг белка. Ферментный препарат не содержит протеаз.

В результате очистки из 5 литров культуральной жидкости получают 170 мг препарата эндо-N-ацетилмурамидазы с удельной

1781296 литической активностью 550 Е/мг белка и

220 мг препарата, содержащего комплекс литических ферментов с удельной литиче ской и протеолитической активностью 750 и

1200 Е/мг белка соответственно.

Пример 2. Продуцент S.levorls 96 культивируют в 100 — литровом ферментере.

В качестве посевного материала используют 48-часовую глубинную культуру S.levorls

96 в количестве 57; от объема питательной среды. Для глубинного культивирования продуцента используют среду. содержащую (7,): кукурузный экстракт — 1,2 (па сырому весу), натрий хлористый — 0,6, глюкоза -0,2 и по ходу ферментации вносится по 0,2 через каждые 24 ч, аммоний сернокислый—

0,4, мел технический — 0,5, крахмал картофельный — 0,6, рН среды 7,4. Готовят в ферментере 50 л питательной среды, которую стерилизуют при давлении 1 атм в течение

30 мин. Перед посевом добавляют 0,15 л подсолнечного масла в качестве пеногасителя. Ферментацию ведут в течение 56 часов при температуре 28 . Скорость вращения мешалки 250 об/мин, аэрация: 1 объем воздуха/ 1 объем среды/мин.

Культуральную жидкость освобождают от мицелия сепарированием. Мицелий отбрасывают. Из оставшегося нативного раствора высаливают белки сульфатом аммония, который вносят в нативный раствор постепенно при перемешивании до конечной концентрации 70% и оставляют на

10 часов при температуре 4О. Недостаточную жидкость декантируют, оставшийся рыхлый осадок центрифугируют при 10000

g в течение 20 мин при температуре 4 С.

Полученный плотный осадок растворяют в 1 литре,0,002 М калий-фосфатного буфера рН

8,0 и проводят в диализ против этого же буфера. После диализа 1/4 часть раствора белков наносят на колонку (3,5 †1 см) с

ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную

0,002 M калий-фосфатным буфером, рН

8,0. Полученную первую фракцию наносят на колонку (3,5 х 60 см) с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 M калий-фосфатным буфером. Белок, элюированный исходным буфером, представляет собой комплекс литических ферментов. Перед элюцией фермента энда-N-ацетилмурамидазы колонку промывают 0,04 M калий-фосфатным буфером рН 8,0. Фермент эндоацетилмурамидазы элюируют 0,08 М калий-фосфатным буфером рН 8,0.

Очистку 3/4 частей ферментного препарата, полученного после диализа, проводят по схеме, приведенной в примере 1. Из 50 литров культуральной жидкости получают

2,1 r препарата, содержащего комплекс литических ферментов с удельной литической и протеолической активностью — 900 и 1050

Е/мг белка соответственно. и получают 1,55

r ферментного препарата энда-N-ацетилмурамидаэы с удельной литической активностью — 480 E/Mã белка.

Способность синтезировать энда-Nацетилмурамидазу определяли также у ряда других штаммов Streptomyces levorls, для чего был использован специфический суб5

10 страт данного фермента — клеточные стенки

Streptococcus pyogenes, группы А, Клеточные стенки получали по (3) путем разрушения клеток стрептококка на экструзионном прессе, с последующей отмывкой и отделеПример 4. Используют культуру

S.levorls К-3326. Условия выращивания и определения энда-N-ацетилмурамидазной активности как в примере 3, которая состав50 ляет для штамма $ levorls К-3326 — 72Я,.

Пример 5. Используют культуру

S.levorls К-3549. Остальное, как в примере

3. Ацетилмурамидазная активность штамма

$Лечог1з -3549 составляет 89

Пример 6. Используют культуру

S.levoris 96. Остальное — как в примере 3.

Лизис клеточных стенок стрептококка (ацетилмурамидазная активность) составляет

937. нием ат клеточных мембран дифференциальным центрифугированием, Пример 3. Культуру S levorls К-4021 выращивают в конических колбах, емкостью

20 250 мл, содержащих по 50 мл жидкой питательной среды следующего состава (%): кукурузный экстракт —, 1 (по сырому весу), натрий хлористый — 0,5, глюкоза — 1, аммоний сернокислый — 0,35, мел технический—

25 0,5, крахмал — 1,5; рН 7,8. В качестве инокулята используют 2-х суточный вегетативный мицелий в количестве 5 (, об., выращенный на этой же среде глубинным способам. Ферментацию ведут на круговой качалке (220

30 об/мин) при температуре 26 С в течение 70 часов. Культуральную жидкость освобождают от мицелия центрифугированием(7000 g, 15 мин), В нативном растворе определяют энда-N-ацетилмурамидаэную активность.

35 Для этого отбирают 2 мл нативного раствора, куда добавляют 1 мл суспензии клеточных стенок стрептококка в 0,075 М фосфатном буфере. Активность определяют турбидиметрическим методом (2) на спект40 рометре при длине волны 650 нм и выражают в процентах уменьшения оптической плотности суспензии клеточных стенок через 60 мин при температуре 37 С. Активность энда-N-ацетилмурамидазы $.levorls

45 К вЂ” 4020 составляет 83 .

1781296

Составитель Л. Кольцова

Техред M.Mîðråíòàë Корректор О. Юрковецкая

Редактор

Заказ 4256 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Установлено, что: 1) способность синтезировать эндо-N-ацетилмурамидазу присуща тем испытанным штаммам вида

Streptomyces levorls,2) применение заявляемого изобретения позволяет увеличить выход препарата энда-й-ацетилмурамидазы в

15-17 раз по сравнению с прототипом, а также повысить удельную активность в 3-4 раза. Увеличивается также количество ферментного препарата, содержащего комплекс литических ферментов, в 4-5 раэ, à его удельная литическая активность повышается в 8 — 10 раз. Кроме этого, упрощается метод очистки ферментов íà KM-целлюлозе за счет отсутствия в ферментном препарате, злюированном с ДЭАЭ-целлюлозы, балластных белков; 3) используемая питательная среда не содержит дорогостоящего гидролизата каэеина фирмы l3ifco получаемого из пищевого продукта — коровьего молока.

Формула изобретения

Способ получения андо-N-ацетилмурамидаэы и комплекса лизирующих ферментов, предусматривающий культивирование продуцирующего штамма Streptomyces

levoris 96 на жидкой питательной среде, содержащей источник углерода. азота, глюко5 зу и натрий хлористый с последующим выделением ферментов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевых продуктов, а также упрощения выделения эндо10 N-ацетилмурамидаэы, в состав жидкой питательной среды дополнительно вводят мел технический в количестве 0,4-0,5 мас.Q, аммоний сернокислый 0,3-0,4 мас. $, в качестве источника углерода ис15 пользуют крахмал картофельный 0,5-0,6 мас., источника азота — кукурузный экстракт в количестве 0,8 — 1,2 мас., rio сырой массе, при этом глюкозу вводят дробно равной порцией через каждые

20 сутки до достижения концентрации в среде 0,4-0,6 мас;,4, устанавливая рН среды 7,4-7,8 и продолжительность культивирования 56-70 ч.