Способ определения индивидуальной чувствительности к нифедипину у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями

 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и другим областям, где применяют лечение антагонистами кальция, в частности нифедипином, и может быть использовано для выбора препарата. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа определения индивидуальной чувствительности к нифедипину. Сущность изобретения: перед началом лечения осуществляют определение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов с использованием 0,5 мкМ АДФ путем лазерной индикации размеров радиусов агрегатов и при значениях до 15 относительных единиц увеличения размеров агрегатов больных считают нечувствительными к нифедипину , а при значениях больше 15 относительных единиц - чувствительными к данному антагонисту кальция. Положительный эффект: способ является достаточно простым, не требует длительного подготовительного периода, по продолжительности занимает не более 1 ч; точность определения выше 93,3%. 1 табл. ел С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (21) 4913634/14 (22) 21.02.91 (46) 07.01.93. Бюл. № 1 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) LLI.Ý.ÀòàxàíoB, Е.В.Балякина, 3.А,Габбасов, Е.Г.Попов и А, П. Юренев (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1642385, кл. G 01 N 33/49, 1989.

2, Авторское свидетельство СССР

¹ 1291873, кл. G 01 N 33/49, 1984, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К НИФЕДИПИНУ У БОЛЬНЫХ

СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и другим областям, где применяют лечение антагонистами кальция, в частности нифедипином, и может

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и другим областям, где применяют лечение антагонистами кальция, в частности нифедипином, и может быть использовано для выбора препарата.

Ионы кальция регулируют множество клеточных процессов и их значение наиболее существенно в возбудимых и секреторных клетках, где такие функции, как сокращение, секреция, агрегация, находятся под кальциевым контролем, Источники кальция могут быть внутрии внеклеточными. К основным механизмам, осуществляющим транспорт внеклеточного кальция, относят активацию расположенных в плазматической мембране специфических кальциевых каналов, Работа Ы 1786437 А1 (5l)5 G 01 N 33 49; 31/ОО быть использовано для выбора препарата.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа определения индивидуальной чувствительности к нифедипину.

Сущность изобретения: перед началом лечения осуществляют определение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов с использованием 0,5 мкМ АДФ путем лазерной индикации размеров радиусов агрегатов и при значениях до 15 относительных единиц увеличения размеров агрегатов больных считают нечувствительными к нифедипину, а при значениях больше 15 относительных единиц — чувствительными к данному антагонисту кальция, Положительный эффект: способ является достаточно простым, не требует длительного подготовительного периода, по продолжительности занимает не более 1 ч; точность определения выше 93,3%. 1 табл. рецепторзависимых кальциевых каналов находится под контролем гормонов, регулирующих обмен фосфоинозитидов в клеточной мембране, таких как адреналин, вазоп рессин, аденозиндифосфэт (АДФ).

Основным гемодинамическим нарушением у больных с гипертонической болезнью (ГБ) является повышение общего периферического сосудистого соп ротивления (ОПСС) в результате артериолярного вазоспазма. Поэтому при лечении ГБ главная цель — расслабить спазмированные артериолы, Использование препаратов с прямым дилятирующим эффектом на артериальную стенку является логичным подходом к лечению.

1786437

К группе периферических вазодилятаторов относятся антагонисты кальция (АК).

Эта группа включает соединения, которые способны изменять клеточные функции кальция, ингибируя его вход в клетку через специфические кальциевые каналы или выход из внутриклеточных депо, либо влияя HB кальцийзависимые процессы. Среди АК выделяют соединения, действующие на плазматическую мембрану, среди которых 10 наибольшее значение имеют блокаторы входа кальция (БВК): верапамил, нифедипин, дилтиазем, БВК являются новым классом препаратов, который нашел широкое применение в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Механизм действия этих препаратов заключается в блокировании входа кальция внутрь гладкомышечных клеток, что закономерно приводит к снижению

ОПСС и АД.

Проблема разработки методов определения индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам, а значит и прогноза эффективности лечения ими, является в настоящее время актуальной.

Известен способ определения индивидуальной чувствительности больных к периферическим вазодилятаторам, включающий биохимическое исследование крови in vitro.

При этом определяют концентрацию ионов кальция в цитоплазме тромбоцитов периферической крови, стимулируют тромбоциты

Са-повышающими гормонам и при повышении содержания ионов кальция в пределах

50-400 нН на пике стимуляции клеток насыщающими концентрациями гормонов больного считают чувствительным к альфа-1-адреноблокатору. Данный способ, включающий трудоемкое выделение тромбоцитов, насыщение их внутриклеточным флуоресцентным зондом, занимает около

3 — 4 ч. Наиболее близким к изобретению по достигаемомуэффекту является способ, при котором индивидуальную чувствительность к препаратам — антагонистам кальция у больных ишемической болезнью сердца определяют, измеряя содержание кальция в плазме крови и в эритроцитах, При величине отношения первого показателя к второму

1,0-1,25 определяют чувствительность к верапамилу в дозе 3,3-3,5 мг/кг массы тела в сутки или коринфару в дозе 1,0 — 1,5 мг/кг, а при значениях 1,26 — 1,55 — к верапамилу в дозе 1,6 — 3,2 мг/кг или коринфару в дозе

0,6-0,9 кг/кг, Меньшие дозы препаратов неэффективны, а большие не дают дополнительного терапевтического эффекта, но вызывают побочные реакции и осложнения.

Данный способ является безопасным для

55 больного, так как исследование проводит я в условиях in vitro. Однако точность способа не является достаточной — 86 — 90%. Не приведены методы определения содержания кальция в плазме и в эритроцитах. Определение кальция в плазме крови не является сложным процессом при использовании стандартного набора химических реактивов фирмы "LACHEMA" (ЧСФР). Определение содержания кальция в эритроцитах, судя по данным научно-технической литературы, является достаточно трудоемкой процедурой, требующей большой подготовительной работы, сложного оборудования, наличия радиоактивных изотопов. Этими условиями ограничивается широкое использование указанного способа, Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа определения Индивидуальной чувствительности к нифедипину.

Цель достигается тем, что в способе c}пределения индивидуальной чувствительно сти к нифедипину при сердечно-сосудистых заболеваниях путем исследования крови у больных гипертонической болезнью перед началом лечения осуществляют in vitro определение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов путем лазерной индикации размеров радиусов агрегатов и при значениях, превышающих 15 относительных единиц (о,е.), больных считают чувствительными к препарату.

Метод лазерной индикации размеров агрегатов основан на анализе флуктуаций светопропускания, вызванных изменениями количества тромбоцитов и их агрегатов в тонком лазерном оптическом канале. Анализатор агрегации (производится совместным Советско-Австралийским предприятием "ASTech"), обладая всеми преимуществами стандартного турбидометарического агрегометра Борна, позволяет измерять в течение заданного времени изменения среднего радиуса агрегатов, которые образуются в процессе спонтанной или индуцированной малыми дозами индукторов агрегации, и имеет значительно большую чувствительность.

Одним из эффективных гипотензивных препаратов — антагонистов кальция является нифедипин (коринфар, адалат) из груПпы

1,4-дигидропиридинов, который широко используется в настоящее время и назначается либо в виде монотерапии, либо в сочетании с бета-блокаторами, метилдопой или клонидином, В результате проведенных клинических исследований 20 больных гипертонической болезнью было установлено, что хронИче1786437

45

55 ская терапия нифедипином в течение 4 — 8 недель была эффективна у тех больных, у кого исходно была повышена агрегация тромбоцитов на 0,5 мкМ АДФ и значения средних радиусов агрегатов тромбоцитов превышали 15 о.е.

Были выявлены достоверные различия между группами больных в зависимости от клинического эффекта: агрегационный ответ у больных без клинического эффекта—

14,0 3,27 о.е., у больных с клиническим эффектом — 67,7 + 22,49 (Р=0,035).

Анализ индивидуальных агрегационных ответов (см. таблицу) показал, что агрегация тромбоцитов в группе больных с агрегационным ответом до 15 о.е, в среднем был 9,8 +. 1,04 о,е., а в группе больных с агрегационными ответами свыше 15 о.е.—

82,8 + 27,02 о.е. (Р=0,0225). При этом точность метода составила 93,3, Приведенные данные свидетельствуют о том, что гипотензивный эффект длительной терапии нифедипином, оцениваемый по снижению уровня АД, зависит от определенной до начала лечения величины агрегационного ответа тромбоцитов.

В рассматриваемом способе предложено осуществлять определение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов путем лазерной индикации размеров радиусов агрегатов, что дает возможность оценивать индивидуальную чувствительность к нифедипину. Обычно агрегацию тромбоцитов изучали при состояниях, связанных с нарушениями в системе гемостаза. Ранее не была известна взаимосвязь агрегации тромбоцитов и чувствительность к антагонистам кальция, то есть не удалось обнаружить решений с признаками, сходными с отличительными от прототипа признаками предлагаемого способа, что позволяет считать предлагаемый способ соответствующим критерию существенных отличий, Способ осуществляют следующим образом, Забор образцов венозной крови проводят утром натощак в положении лежа после

30 мин отдыха с помощью иглы "butterflyneedle 19 g" (CLUA) обычно в количестве 9 мл.

Кровь стабилизируют 0,13 М цитратом натрия (рН 7,4; раствор фильтруют через фильтр milli-роге 0,4 мкм, соотношение кровь: антикоагулянт = 1:9).

Для исследования активности тромбоцитов на анализаторе агрегации готовят суспензию тромбоцитов с фиксированной и равной 0,25 процентной объемной концентрацией тромбоцитов в ней, что соответствует 200000 тромбоцитов в 1 мкл. Это связано

35 с тем, что показания канала регистрации изменений среднего радиуса агрегатов зависят именно от концентрации тромбоцитов. Поэтому после определения объемной процентной концентрации тромбоцитов в исследуемой крови исходную богатую тромбоцитами плазму (БТП) разбавляют при необходимости аутологичным образцом обедненной тромбоцитами плазмы (ОТП).

БТП готовят центрифугированием в течение 10 мин при 200 g (1400 об/мин, центрифуга "Т-23 Janetzki;, ГДР). Из пробирки отбирают 2 мл супернатанта (верхнего слоя, здесь: БТП), которые хранят при комнатной температуре для возможного последующего разбавления.

Измерение объемной концентрации тромбоцитов в исходной БТП проводят с помощью специальной микроцентрифужной тромбоцитокритной кюветы с переменным сечением, у которой нижняя часть является градуированным капилляром (в использованной в данной работе кювете 1 мм высоты капилляра соответствовал 1 мкл объема крови). В такую кювету помещают 50 мкл 100 мМ ЭДТА и 500 мкл богатой тромбоцитами плазмы. Кювету и пробирку с остатками крови центрифугируют при 2000 g в течение 20 мин (4000 об/мин).

ОТП составляет верхний прозрачный слой в пробирке с остатками крови.

Встряхиванием удаляют жидкость из микроцентрифужной кюветы. При помощи микроскопа (8-кратное увеличение) определяют высоту тромбоцитарного столба (в см).

Объемную концентрацию тромбоцитов высчитывают по формуле 1: Сое-Чтромб: где

Vppp 6 высота тромбоцитарного столба в см; С г — объемная процентная концентрация тромбоцитов.

Количество ОТП, которое необходимо добавить в исходную БТП для доведения С г, до 0,25, высчитывают по формуле 2:

VoTn=VE Tn*(Coe:0,25-1).

3а 3 мин до начала измерений образец помещают в кюветное отделение или ячейку для прединкубации и инкубируют при 37 С (3 мин необходимы для полного прогрева содержимого кюветы). Исследование проводят в течение 1 ч с момента забора крови.

В качестве индуктора агрегации используют

АДФ, который добавляют после звукового сигнала, то есть спустя 30 с после помещения исследуемого образца в регистрационную ячейку. Тромбоциты стимулируют АДФ в конечной концентрации 0,3 — 0,7 мкМ, оптимальной является 0,5 мкМ. При концент1786437

10

20

55 рациях ниже 0,3 мкМ агрегация происходит слабо, что не соответствует задачам эксперимента. При концентрациях выше 0,7 мкМ также меняется кинетика процесса.

Все вычисления, а также контроль и регулировка температуры кюветного отделения и скорости перемешивания образца осуществляют встроенным микроконтроллером.

Степень агрегации тромбоцитов (величину агрегационного ответа) оценивают по максимальному увеличению сигнала на экране компьютера, отражающего изменения среднего размера агрегатов тромбоцитов в суспензии. При этом значения сигнала от одиночных клеток (перед добавлением индуктора) принимают за 1.

При значениях радиуса агрегатов тромбоцитов после добавления в суспензию клеток 0,5 MKM АДФ меньше 15 о.е. (по шкале ординат) больного считают нечувствительным к нифедипину. Если значения превышают 15 о.е. — чувствительным, и ему можно эффективно проводить лечение нифедипином.

Способ поясняется следующими примерами, Пример 1. Больной М-ш, 51 г. Находится на диспансерном учете в научно-консультативном отделе Института клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ВКНЦ АМН СССР с высокими цифрами артериального давления, Повышение давления отмечает в течение 12 лет.

Диагноз: гипертоническая болезнь 11 А стадии.

За неделю до обследования больному была отменена гипотензивная терапия, при необходимости был разрешен прием клофелина, В день обследования; АД вЂ” 180/115 мм рт.ст., ЧСС вЂ” 68 в 1 мин. У больного была взята кровь в количестве 9 мл, После первого центрифугирования объем БТП составил

2 мл. После второго центрифугирования высота тромбоцитарного столба — 2 см, Согласно формуле 1 объемная концентрация тромбоцитов в исследуемой плазме составила 0,4 (2:5=0,4), Расчет разведения БТП по формуле 2;

1) 0,4;0,25 =1,6, 2) 1,6-1=0,6 — следовательно, для получения плазмы с заданной объемной концентрацией 0,25 необходимо на 1 мл БТП прибавить 0,6 мл ОТП.

3) 0,6*2=1,2. Итак, к 2 мл БТП было прибавлено 1,2 мл ОТП, При изучении агрегационных ответов на 0,5 мкМ АДФ было получено значение максимального радиуса агрегатов тромбоцитов 137,5 о.е, На основании этого больного можно было считать чувствительным к нифедипину. Было высказано предположение, что терапия нифедипином у данного больного будет эффективной, Назначен "коринфар" ("Germed", ГДР) в разовой дозе 20 мг, суточной дозе 60 мг.

Эффективность лечения подтвердилаСь повторным исследованием через 6 недель.

В день повторного обследования: АД—

160/95 мм рт.ст., Ч СС вЂ” 64 в 1 мин, Систолическое АД снизилось на 11,1 j от исходного уровня, а диастолическое АД вЂ” на 17,4 /.

Данный пример иллюстрирует совпадение благоприятного прогноза применения

АК с эффективностью лечения. Таким образом, больного можно считать чувствительным к антагонисту кальция — нифедипину, Пример 2, Больной О-в, 38 лет.

Находится на диспансерном учете в научноконсультативном отделе Института клинической кардиологии им, А.Л,Мясникова

ВКНЦ АМН СССР с высокими цифрами артериального давления, Повышение давления отмечает s течение 9 лет.

Диагноз: гипертоническая болезнь II Б стадии. Относительная коронарная недостаточность. Пролапс митрального клапана.

За неделю до обследования больному были отменены гипотензивные препараты, разрешен прием клофелина. В день обследования; АД вЂ” 150/100 мм рт.ст„ЧСС вЂ” 78 в

1 мин. У больного была взята ковь в количестве 9 мл. БТП сохранена в количестве 2 мл, По формуле 1 объемная концентрация тромбоцитарного столба — 1,6 см (1,6:5=0,32).

Расчет разведения БТП по формуле 2:

1) 0,32:0,25=1,28.

2) 1,28-1=0,28 — следовательно, для получения плазмы с заданной объемной концентрацией 0,25 необходимо на мл БТП прибавить 0,28 мл ОТП.

3) 0,28*2=0,56. Итак, к 2 мл БТП было прибавлено 0,56 мл ОТП, При изучении агрегационных ответов на

0,5 мкМ АДФ было получено значение максимального радиуса агрегатов тромбоцитов

8,7о.е. Предположили, что s данном случае нифедипин не будет оказывать выраженного гипотензивного действия. Назначен "коринфар" в разовой дозе 10 мг, суточной дозе

30 мг.

Неэффективность лечения подтвердилась повторным исследованием через 4 недели. В день повторного обследования; АД вЂ” 140/105 мм рт,ст„ЧСС вЂ” 75 в 1 мин. СИстолическое АД снизилось на 6,7 от исходного уровня, а диастолическое АД повысилось на 5/.

1786437

50

Данный пример демонстрирует неблагоприятный эффект применения АК у нечувствительного к нифедипину больного.

Пример 3. Больной Б-н, 50 лет.

Находится на диспансерном учете в научноконсультативном отделе Института клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова

ВКНЦ АМН СССР с высокими цифрами артериального давления. Повышение давления отмечает в течение 11 лет.

Диагноз: гипертоническая болезнь ll А стадии. Желудочковая экстрасистолия.

3а неделю до обследования больному была отменена антигипертензивная терапия, при необходимости был разрешен прием клофеллина. В день обследования: АД—

150/100 мм рт,ст., ЧСС вЂ” 70 в 1 мин. У больного была взята кровь в количестве 9 мл. БТП сохранена в количестве 2 мл. Объемная концентрация тромбоцитов в исследуемой плазме по формуле 1 составила 0,3 — высота тромбоцитарного столба 1,5 см (1,5:5=0,3).

Расчет разведения БТП по формуле 2;

1) 0,3:0,25=1,2, 2) 1,2-1=0,2 — следовательно, для получения плазмы с заданной объемной концентрацией 0,25 необходимо на 1 мл БТП прибавить 0,2 мл ОТП, 3) 0,2х2=0,4. Итак, к 2 мл БТП было прибавлено 0,4 мл ОТП.

При изучении агрегационных ответов на 0,5 мкМ АДФ было получено значение максимального радиуса агрегатов тромбоцитов 25,3 о,е.. Было высказано предположение, что терапия нифедипином у данного больного будет эффективной. Назначен "коринфар" (ГДР) в разовой дозе 10 мг, суточной дозе 30 мг.

Эффективность лечения подтвердилась повторным исследованием через 6 недель.

В день повторного обследования: АД—

130/90 мм рт.ст., Ч СС вЂ” 70 в 1 мин. Систолическое АД снизилось на 13,37, от исходного уровня, а диастолическое АД вЂ” на 10,0 .

5 Данный пример иллюстрирует совпадение благоприятного прогноза применения антагониста кальция у чувствительного к нифедипину больного.

Таким образом, предлагаемый способ

10 определения чувствительности к нифедипину является достаточно простым, не требует длительного подготовительного периода, по продолжительности занимает не более 1 ч, в то время как по прототипу требуется 3 — 4

15 ч. Точность определения чувствительности к антагонистам кальция по данному способу выше (93,3 ), чем в прототипе (86 — 90%).

Предлагаемый способ позволит повысить эффективность лечения нифедипином за

20 счет обоснованного подбора больных, чувствительных к этому препарату, Индивидуальные значения агрегации тромбоцитов и клиническая эффективность лечения нифедипином больных гипертони25 ческой болезнью приведены в таблице.

Формула изобретения

1. Способ определения индивидуальной чувствительности к нифедипину у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями пу30 тем исследования крови, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью точности и упрощения способа, у больных определяют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, при этом осуществляют лазерную индикацию

35 размеров радиусов агрегатов и при значении, превышающем 15 относительных единиц, больных считают чувствительными к препарату, 2. Способ по п,1, отличающийся

40 тем, что АДФ используют в конечной концентрации 0,3 — 0,7 мкМ.

1786437

Больные

ГБ

Средний радиус агрегатов относи тельные единицы

Эффективность лечения

П р и м е ч а н и е. Эффективность лечения оценивается в дельта Ф изменения диастолического артериального давления на фоне лечения, причем положительные значения дельта о; соответствуют снижению .АД, а отрицательные - его повышению Составитель Ш. Атаханов

Техред М,Моргентал Корректор Э, Лончакова

Редактор

Заказ 245 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

2

4

6

8

11

12

13

14, 15

16

17

18

19

6,5

8,7

10,2

11,1

12,6

16,2

16,6

19,4

19,9

20,3

20,6

25,3

27,4

32,2

46,2

46,8

67,5

137,5

187,7

299,3

-5,0

-9,1

4,8

20,0

16,7

16,7

25,0

10,7

10,0

4,5

9,1

10,0

12,5

9,1

17,4

12,5

17,6