Птичий репеллент

 

Использование: борьба с птицами, в частности соединения, применяемые в качестве репеллентов для птиц, Сущность изобретения: применяют соединения формулы (I) Хг Х-/ Rt R 3 H-C-Y U, ч J fit где Xi и Xs каждый в отдельности выбирают из водорода и Ci-Ci-алкила, галогена и галоидзамещенных аксиальных групп с 1-4 углеродными атомами; Х2, Хз, Хз каждый в отдельности выбирают из водорода и Ci-Cj- алкила, окиси, (и-Сд-алкоксигруппы и феноксигруппы; RI и R2 каждый в отдельности выбирают из водорода и алкильных групп с 1-4 углеродными атомами; Вз и R каждый представляет собой водород или вместе образуют вторую связь углерод-углеродной двойной связи, соединяя - CRiRa- и -CR2R4-; и Y является карбамоилом или карбамоилом, замещенным одной или двумя одинаковыми или различными алкильными группами с 1-4 углеродными атомами, или соединения формулы (I) выбирают из 3,5-диметоксикоричной кислоты и ее сложных эфиров и солей и дополнительно из амида коричной кислоты в качестве птичьего репеллента . 6 табл. 00 ы XI

(21 4614786/15 (86 РСТ/GB 88/01107 (14.12.88) (22 11.08.89 (46 30.08.93 Бюл, ¹ 32 (31- 8729109 (32. 14.12.87 (33 GB (71 Нэшнл Рисерч Дивелопмент Корпорейше (GB) (72)) Питер Уильям Грейг-Смит и Майкл

Ф энк Уилсон (GВ) (56 Патент Японии № 289003, кл 3(2) — 105(62), 1986, Патент Японии № 52884, кл, 7(1) — 25(115), 19 1. (54 ПТИЧИЙ РЕПЕЛЛЕНТ (57- Использование: борьба с птицами, в ча тности соединения, применяемые в каче тве репеллентов для птиц, Сущность из бретения: применяют соединения форму ы (I) К Х В Ец где Х> и Х каждый в отдельности выбирают из водорода и С -С4-алкила, галогена и галоидзамещенных аксиальных групп с 1 — 4 углеродными атомами; Х, Хз, Х4 каждый в отдельности выбирают иэ водорода и С -С4алкила, окиси, С -С4-алкоксигруппы и феноксигруппы; R1 и R2 каждый в отдельности выбирают из водорода и алкильных групп с

1 — 4 углеродными атомами; Вз u Rp каждый представляет собой водород или вместе образуют вторую связь углерод-углеродной двойной связи, соединяя — CR>Ra- и -CRzR4-;

u Y является карбамоилом или карбамоилом, замещенным одной или двумя одинаковыми или различными алкильными группами с 1-4 углеродными атомами, или соединения формулы (1) выбирают из 3,5-диметоксикоричной кислоты и ее сложных эфиров и солей и дополнительно из амида коричной кислоты в качестве птичьего репеллента. 6 табл.

Изобретение относится к борьбе с птица и, в частности к соединениям, применяем м в качестве репеллентов для птиц.

Изобретение заключается в примене! ни в качестве репеллента для птиц соедине ия формулы (3)

ХгХ1 К1 г ! х с-с- з

Х Х з где х> и xs каждый по отдельности выбирают из водорода С>-С4-алкила, галоида и галоидзамещенного С1-С4-алкила; х2, хз и х4 каждый независимо выбирают из водорода, С>-С4-ал кила, гидроксила, С -С4-алкоксигруппы и феноксигруппы; Ri u Rz каждый в отдельности выбирают иэ водорода и С>-С4алкила; R4 представляет водород или вместе образуют вторую связь углерод-углеродной двойной связи, соединяющ ю -CR|Ra- uCR2R4-, Y — гидроксиметил, формил, циан, карбамоил, карбамоил, N-замещенный одним или двумя одинаковыми или различны1837766 ми CI-С4-алкилами, карбоксил или карбоксильный эфир, или карбоксилатную соль.

Общие предпочтения. при рассмотрении соединений формулы (I) заключаются в следующем, Х и Хв обычно каждый по отдельности выбирают из водорода или в меньшей мере степени иэ С>-С4-алкйла или же из галоида, такого как фтор, хлор, бром или иод или в меньшей степени дополнительно из галоидзамещенного метила, например трифторметила, х, хз и х4 обычно

10 каждый по отдельности выбирают из водорода или С1-С4-алкоксигруппы, особенно этоксигруппы и, в частности, метоксигруппы или в меньшей степени из феноксигруппы, а также гидроксида. Что касается Ri u

Rz, то их предпочтительно каждый по отдельности выбирают из водорода, метила или этила, особенно иэ метила и, в частности, из водорода. Обычно каждый R> и Rg 20 представляют водород или один иэ них, редпочтительно Й представляет водород, . торой -С1-С4-алкил, предпочтительно метил, R3 и R4 предпочтительно вместе образуют вторую связь двойной связи. У вЂ” формил 25 или более предпочтительно карбоксил или сложный эфир, или соль его и, в частности карбамоил, замещенный двумя или предпочтительно одним С1-C4-алкилом, например этилом, или, в частности, метилом, или 30

- особенно незамещенный карбамоил. Эфиры обычно образованы алифатическими или ароматическими спиртами, в частности, спиртами, содержащими алифатическую углеводородную С1-С24 группу, например ал- 35 кил или алкенил или ароматическую углеводородную группу, такую как незамещенный или замещенный нафтил и в особенности фенил, в то время как соли могут быть образованы с различными органиче- 40 скими и неорганическими основаниями, например гидроксидом щелочного металла, таким как гидроксид натрия, гидроксид четвертичного аммония или амином, таким как

2-амина-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол - 45 (трис). Применение таких производных, обычно имеющих физиологически приемлемую форму, может представить интерес для приго говления составов. Так, эфиры с более длинной алифатичес кой углеводородной группой менее растворимы в воде, а многие соли лучше растворимы в воде по сравнению со свободными кислотами.

Особый интерес представляет соединение, где Х и Х4 каждый flo отдельности 55 представляет С>-С4-алкоксигруппы, например этоксигруппу, но особенно метоксигруппу, обычно при наличии групп Х>, Хз и Хб, где Х> и Х каждый представляет водород; а

Хз — C>-С4-алкоксигруппа, например этоксигруппа, но особенно метоксигруппа, или предпочтительно каждый представляет водород, Или же особый интерес представляют другие соединения, в которых Х, )4, Хз, Х4 и Хв каждый представляет водород, Эти, представляющие особый интерес соединения, обычно замещены группами Йз и R4, образующими вторую связь углерод-углеродной двойной связи в особенности в сочетании с В1 и Rz, каждый из которых представляет водород, в особенности, если

У представляет карбоксил или в меньшей степени карбоксильный эфир или карбоксилатную соль или более предпочтительно карбамоил или в меньшей степени N-замещенный карбамоил.

Примеры Специфичных соединений, применяемых в изобретении, включают (1) 3,5-диметоксикоричная кислота, а та.кже ее соли и эфиры; (2) 2,4,5-триметоксикоричная кислота, а также ее соли и эфиры; (3) 3,5-диметилсициннамид; (4) 3,4,5-триметилксициннамид; (5) циннамид;

Из соединений (1), (3) и (5) наибольший интерес представляют соединения (1) и особенно (5), которые и рекомендуются в качестве репеллентов для птиц.

Изобретение относится к применению соединений формулы (!) в качества репел-. лента для птиц и не ограничивается какойлибо теорией в отношении характера действия таких репеллентов. Тем не менее, особая эффективность соединений формулы (!) может заключаться в их способности ингибировать биохимический процесс ферментивного протеолиза, протекающего в тонкой кишке птиц. Такое ингибирование снижает питательное качество пищевых продуктов, потребляемых птицей, и в свою очередь не привлекает птиц к дальнейшему кормлению на обработанном урожае, Наши опыты показали, что многие соединения формулы (I) влияют на активность щелочных серинпротеазы в тонкой кишке птиц в определенной степени, и нам удалось показать, что ингибирование активности фермента соединениями формулы (I) происходит селективно с бесконкурентным связыванием на активном участке щелочной серинпротеазы или вблизи него и в результате со снижением потенциала этого участка к связыванию и гидролизу его обычного белкового субстрата.

Основной щелочной серинпротеазой у птиц является либо химотрипсин, например у перепелов и скворцов, или трипсин, например у снегирей и голубей. НайденЬ. что относительная степень ингибирования хи1837766

55 отрипсина и трипсина меняется для разичных соединений формулы (1). Если активость соединений формулы (1) в качестве тичьего репеллента в первую очередь опеделяется их способность ингибировать ермент, то это открытие потенциально огло бы иметь важные последствия, покольку для оптимизации репеллентного ффекта на всех птиц можно выбрать либо оединение формулы (1). эффективное как о отношению к химотрипсину, так и трипину, либо соединений формулы (1), одно из оторых особенно эффективно по отношеию к химотрипсину, а другое — к трипсину. ли же в определенных ситуациях может казаться желательным отпугивать одних тиц, но не других. Так; например, снегиряи наносится особый урон почкам фруктоых деревьев, в то время как вред от ольшинства других птиц гораздо меньше, эти птицы могут оказаться полезными в орьбе с насекомыми. При этом возникает озможность, при которой оказывается редпочтительным отпугивать снегирей изирательно, и возможный подход заключатся в применении соединения формулы (1), оказывающего высокую степень ингибиования трипсина при низком уровне ингиирования химотрипсина.

Таким образом, предпочтительность содинений формулы (I) далее обсуждается с собой ссылкой на наши открытия в связи с х ингибирующим действием на ферменты имотрипсина и трипсин. Однако, необхоимо указать, что соединения формулы (1) казывают свое действие на двух уровнях: ервое действие определяется просто их еприятным вкусом, а второе действие заисит от влияния на пищеварение птиц. Хоя второе действие видимо, зависит от вида тиц, первое от этого не зависит. В самом еле, как более подробно обсуждается ние, при кормлении первый эффект, видимо, вляется преобладающим, поскольку стеень отвращения к потреблению пищи, обаботанной соединением формулы (I), не оррелируется тесно с активностью по инибированию фермента соединениями форулы (1).

Что касается активности по отношению трипсину, то соединения формулы (I), где

1 = Xz = Хз = Х4 = Xg = Н и Y = СОННО (или амещенный карбамоил) или COzH (или фир, или производное в виде соли), обычно ри Ri Rz = Н и Rs+ R4= связь, как правило, имеют тенденцию к особой эффективности качестве ингибиторов трипсина. Соединеие, гле Y = C0zH, по наблюдениям нескольо более эффективны, чем эквивалентное оединение, где V = CONHz, и в самом деле

40 при испытании на кишечный трипсин голубя, но не на кишечный трипсин снегиря активности для циннамида вовсе не наблюдалось. В отличие от ингибирования химотрипсина соединения формулы (1), где

Х и Х представляют водород и один или алкоксигруппу, например метоксигруппу, как правило имеют тенденцию быть худшими ингибиторами трипсина по сравнению с соответствующими незамещенными в кольце соединениями. Для применения в качестве ингибитора трипсина рекомендуются такие соединения формулы (I) как коричная кислота (X1 = Xz = Хз = Хд = Хь - Н, Rl Rz=H, Из +. Я1 = связь и Y - C0zH) или ее эфир или производное в виде соли и по меньшей мере по отношению к снегирю циннамид (X1 = Xz = ХЗ = X4 = X5 = H, RI = Rz = H, Rs +

+R4 = связь и Y = CONHz).

Что касается активности по отношению к химотрипсину, то при использовании в испытании кишечного химотрипсина перепадов соединения формулы (1), где Y = COzH или особенно СНО, как правило, являются эффективными ингибиторами химотрипсина, однако в случае соединений, где Y =

=CONHz, они менее эффективны, соединения же, в которых V представляет циан или гидроксиметил занимают промежуточное положение по своему действию между соединениями, где Y = СОИН2 и СОгН. Соединение формулы (1), где RI = Rz = Rs = R4 = Н имеют тенденцию быть менее эффективными, по сравнению с соединениями, где RI=Я = Н и Rs+ R4 = связь, однако соединения, где В1 = СНз, Rz = Н и Из + R4 = связь, могут оказаться также хороши или несколько более лучшими, чем их эквиваленты, где R> представляет водород, Основное действие на ингибирование химотрипсина, однако, как было обнаружено, оказывает замещение бензольного кольца в соединении формулы (I) заместителями Xz, Хз, Х4.

Как правило, замещение в одном из 3-, 4- и 5-положений бензольного кольца гидроксилом или алкоксигруппой, например метоксигруппой, увеличивается степень ингибирования, хотя это и не относится к

4-гидроксикоричной кислоте (X> = Xz = Хз=Х5 = Н, Xs = CH, RI = Rz = Н, Rs = R4 = связь, Y = СОгН). Так, для всех следующих соединений формулы (I) наблюдается повышение эффективности по сравнению с коричной кислотой, и соединения 1 — 7 расположены в порядке повышения наблюдаемого уровня активности (в каждом соединении В1 = Rz=H, Rs+ R4 = связь, Y - СОгН). (1) 3-гидроксикоричная кислота (X =X3 - Х = Xs - Н, Xz = ОН);

1837766

10 ингибитора химотрипсина соединения обычно замещены двумя или тремя группа- 15 ми Хг, Хз и Х4, обычно группой Хз и одной

25 (2) 3-метоксикоричная кислота (Х - Хз =

Х4 Xg Н, X2 = ОСНз) (3) 3,5-диметоксикоричная кислота (Х =

=Хз = Xs = Н, X2 = Х4 - О СНз); (4) 3,4-диметоксикоричная кислота (Х =

=X4 = Хь = Н, Х2 = Хз = OCI!); (5) 3,4-дигидроксикоричная кислота (Х1 = Х4 - Хь = Н, Хг = Х з= ОН); (6) 3,4,5-триметоксикоричная кислота (Х1 = Х5 = Н, Хг = Хз = Х4 - ОСНз); (7) 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричная кислота (X1- Xs= Н, Хг - Х4 = ОСНз, Хз= ОН).

Таким образом, рекомендуемые на роль или обеими группами Хг, Х4, которые каждая по отдельности представляют гидроксил или алкоксигруппу, в частности, гидроксил или метокси груп пу, Из + R4 обычно и редставляют связь, а R< и R2 обычно каждый выбирают из водорода, метила и этила, в частности, водорода и метила, например

R1= Вг= Н, В1=СНз, R2=H.У обычно представляет СОгН или эфир, или производное в виде соли, но особенно СНО. Особенно рекомендуются соединения (4), (5), (6) и (7) и их аналоги, где (а) R > = СНз, (в) V = С НО и (с) R> ==СНз и V = СНО..

Из приведенного обсуждения можно сделать вывод, что с учетом ферметивной активности, соединения, проявляющие высокую активность по ингибированию химитрипсина, могут быть использованы в сочетании с соединениями, типа описанных выше, проявляющими высокую активность по ингибированию трипсина, так например, 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричная кислота и коричная кислота при их совместном употреблении должны показать высокую активность по отношению к обоим ферментам.

Или же одно соединение формулы (I) при его употреблении может показать приемлемый, если не высокий, уровень ингибирования обоих ферментов и одним из возможных таких соединений является 3,4-диметоксикоричная кислота.

Необходимо указать, что настоящее изобретение охватывает и те соединения, которые отвечают общей формуле (I) и сами по себе являются новыми.

Способы синтеза соединений формулы (!), применимые в настоящем изобретении, специалисту совершенно очевидны, Так, соединения могут быть синтезированы по описанным в литературе методикам синтеза конкретных соединений или их аналогов по видоизмененным описанным методикам, или по методикам, приведенным для родственных соединений или их модификаций, В

55 частности коричную кислоту удобно получать реакцией Перкина из беизальдегида, например, использованием уксусной кислоты и безводного ацетата натрия или калия, а замещенные в кольце производные могут быть получены аналогично из замещенного бензальдегида. Соединения с модифицированным карбоксилом могут быть получены из соответствующей коричной кислоты с любой необходимой защитой, заместителей в ходе синтеза. Так, к примеру, циннамид может быть получен реакцией циннамоилхлорида (который может быть получен из коричной кислоты в реакции с тионилхлоридом, треххлористым фосфором или пятихлористым фосфором), с аммиаком или образованием аммониевой соли коричной кислоты в реакции с аммиаком с последующим превращением соли в циннамид при нагревании. Замещенные в кольце производные получают из замещенной коричной кислоты и N-замещенных производных с использованием вместо аммиака соответствующего амина. Дигидрокоричная кислота, где Кз и R4 каждый представляет водород, может быть получена гидрированием углерод-углеродной двойной связи коричной кислоты, например, в присутствии никелевого катализатора, Замещенные в кольце производные могут быть получены аналогично с защитой при необходимости заместителей, а соединения с группой У, отличной от карбоксила, могут быть получены либо из соответствующих насыщенных соединений аналогичным путем с защитой в случае необходимости группы У, либо модификацией карбоксида соответствующей дигидрокоричной кислоты.

Проведены опыты с кормлением как японских перепелов, образующих химотрипсин s качестве основной щелочной серинпротеазы, так и диких голубей, образующих трипсин в качестве OcHQBHQA щелочной серинпротеаэы. При этом наблюдается отпугивание в различной степени, но при сравнении отношений потребленной обработанной пищи в испытании с двойным выбором все соединения формулы (I) показали отпугивающее действие, которое было особенно заметно в порядке возрастания эффекта для 3,4,5-триметоксикоричной кислоты, 3,5-диметоксикоричной кислоты и циннамида. Циннамид испытан и на перепелах и на голубях после того, как было отмечено различное действие на потребление пищи обоими видами птиц.

Соответственно, соединения формулы (!) представляют интерес с точки зрения отпугивания самых различных птиц вне зависимости от того, является ли их основной

1837766

30

40

55 елочной серинпротеазой химотрипсин и и триспсин, хотя эти соединения предс авляют особый интерес в случае некотор х птиц, с которыми связаны особые и облемы, таких как, голуби и снегири, а т кже скворцов и ласточек, не исключая гус й, например; гуся Брента или канадского

r ся (Branta canadensls), краснокрылый труп ал (Agelius phoemiceus), и коричневоголов и желтушник (Molothrus ater) в США, т ачиков, например, Quelea guetea в Африке и индийская домовая ворона в Индии и Афр ке.

Особая область применения соединен и заключается в обработке садов для п едотвращения повреждения развиваюхся почек, особенно в сезон покоя для ф уктовых почек, например, яблонь, груш, с ив и т.д„созревающих фруктовых деревье, особенно вишен, созревших ягод и плод вого кустарника перед сбором урожая, н пример: малины, земляники, логановой я оды, ежевики, черной смородины, крыж вника и т.д. Другие применения включаю защиту высеянных семян будущего у ожая, особенно подсолнечника и рапса, Т ким образом, можно сделать вывод, что с единения формулы (I) могут быть использ ваны для защиты любого растительного м териала, который может находиться в зар дышевой, развивающейся или зрелой ф рме, в том числе, в виде семян, ростков, и чек, листьев и других вегетативных частей и фруктов. Соединения формулы (I) могут т кже представлять потенциальный интер с в любом контексте там, где желательна з щита от птиц, например, для защиты строе ий и особенно электрокабелей от проклев вания птицами.

Соединения формулы (!) могут быть введ ны в состав для обработки с различного. т па приемлемыми разбавителями или нос телями, особенно для применения в сель. с ом хозяйстве (садоводстве, в том числе: в дные составы, масляные составы и т.д.).

О ин из приемлемых типов составов включ ет состав с применением в качестве раэб вителя водного ацетона, особенно при б льшем содержании воды чем ацетона, наи имер 60 — 90% воды: 40-10% ацетона (по о ьему), в частности, 80% воды: 20% ацет на (по объему). Однако могут быть иси льзованы различные альтернативные р збавители или носители, приемлемые для н несения на культурные растения, с целью и лучения растворов, суспензий, эмульсий и и порошков, содержащим соединения ф рмулы (1). При создании более сложных т пов композиций преследуется цель усил ть активности соединения путем его представления в более эффективной физической форме с исключением какой-либо маскировки отпугивающего действия при изготовлении состава. Особый интерес представляют составы продленного действия, оказывающие более продолжительное действие от разового нанесения соединения, при этом количество соединения устанавливают на необходимом уровне путем уравновешивания разложения уже выделившегося соедиенения с выделением дополнительных количеств соединения. Для этой цели применимы самые различные типы составов продленного действия, но особый интерес представляют микрокапсулированные составы, например. в капсулах иэ полимочевины. В случае композиций для обработки созревших семян для создания порошкообразных композиций могут использоваться твердые носители, например, различные глины, такие как каолин и бентонит в смеси, если необходимо, с эмульгатором, В композицию, предназначенную для применения в настоящем изобретении, вместе с соединением формулы (1) могут быть включены различные другие компоненты. 8 их числе эмульгаторы, способствующие приготовлению композиции и ее нанесению на растение или другой материал.

Приемлемыми эмульгаторами, в частности, являются неионные поверхностноактивные вещества, в особенности имеющие строение простых полиэфиров. например; полиоксиэтиленстеарат и нонилфенилполиоксиэтанол, Другие типы дополнительных компонентов, которые могут претендовать на включение в композиции, включают различные красители, например, такие продажные вещества как

Rhoplex АС-33, Trltlon АВ и Acronal UD (BASF) поскольку птиц отпугивают незнакомые и отталкивающие зрительные образы, средства, способствующие налипанию композиции на материал вещества, на который ее наносят, например, Sky Blue и другие продажные пищевые красители, а также инсектициды, фунгициды и т.д., если необходимо. Необходимо также указать, что композиция может содержать более одного соединения формулы (l), например одно соединение, особенно эффективное при ингибировании химотрипсина, и другое соединение, особенно эффективное при ингибировании трипсина, поскольку такой подход часто более удобен, чем нанесение этих же двух соединений по отдельности.

Обработку проводят в необходимое время либо заранее, либо в ответ на нападение птиц, Для защиты плодовых почек такую

1837766

10

25

50 обработку обычно проводят в сезон покоя, т.е. поздней осенью, зимой или ранней весной, например, в Великобритании с ноября по февраль. Нанесение композиции, содер жащей соединение формулы (I), может быть осуществлено с помощью стандартных средств, часто путем опрыскивания,-например использованием в садах барабанного опрыскивателя, и при необходимости обработки может быть повторена для поддержания необходимого уровня борьбы с птицами. Дополнительная информация, касающаяся составов и применения птичьих репеллентов, дается с привлечением данных о применении вне Великобритании существующих репеллентов, таких как антрохинон, тирам, алюминийаммонийсульфат, экстракт квассии и особенно метиокарба.

Наносимые дозировки соединений зависят как от конкретно применяемого соединения формулы (I), так и от природы и местонахождения обрабатываемого материала. Однако, для сведения можно указать, что для обработки созревающего урожая часто достаточной оказывается дозировка

0,1 — 100, особенно 1-10 кг на 1 ra соединения формулы (I), имея целью применение минимального эффективного количества, которым может оказаться например, дозировка в 5 кг на 1 га или еще меньше. Для обработки созревшего урожая семян часто достаточной оказывается применяемая дозировка в 0,01 — 1, особенно 0,050,5 мас.%!ìàñ, соединения формулы (О на обрабатываемый материал. И в этом случае имеется в виду применение минимального эффективного количества, которое может составить, например, 0,1 мас.$/мас, или еще меньше.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами (используемые ниже соединения формулы (I) находятся преимущественно в изомерной транс-форме).

Пример 1, Опыты с птичьей протеазой. (А) Получение экстракта протеазы.

Птицы (пятинедельные самки японского перепела, дикие отловленные в ловуШки снегири и голуби) умерщвляются, тонкую кишку и мускульный желудок извлекают и на 5 мин погружают в жидкий азот. Замороженные ткани мускулистого желудка и тонкой кишки затем по отдельности лиофицируют в течение 24 ч,размалывают в мелкий порошок в молотковой мельнице и хранят в эксикаторе при -20 С до употребления в анализе.

Высушенный порошок тканей птичьей кишки (500 мг) экстрагируют 30 мин соответствующим буфером (испытание на кислую протеазу: 10 мМ HCI "испытание на щелочную протеазу: 100 мМ Трис-HCI (трис является аббревиатурой для 2-амино2-гидроксиметилпропан-1,3-диола) буфера с рН 7 (10 мл)/при комнатной температуре.

Экстракт центрифугируют при 22000 g в течение 30 мин при 4 С и полученную жидкую часть отбирают для последующего испытания, (В) Определение активности протеазы. (1) Кислотную активность протеазы определяют по методике Рика и Фритча с применением экстракта гемоглобина. Реакцию в пластиковых разовых пробирках на 4 мл, заполненных субстратом гемоглобина (лиофилиэованный порошок бычьего гемоглобина, 200 мг/мл в 10 мМ HCI (т.е. 10 мМ водной соляной кислоте) (1мл)/ и 1 мМ HCI (40 мкл), Реакцию начинают добавлением экстракта кишки (200 мкл) и прекращают через 10 мин добавлением 57;-ной (масс./об) трихлоруксусной кислоты (2 мл).

Содержимое пробирок смешивают и центрифугируют 20 мин при 4000 g. Аликвоты полученной жидкой части (1 мл) добавляют к 0,5 M. NaOH (2 мл) в пластиковых кюветах (1 х 1 х 4 смз).

Затем добавляют реактив Фолин-Циокалто, разбавленный в отношении 1:3 (об/об) дистиллированной водой (0,6 мл разбавленного реактива) и спустя 9 мин наблюдают поглощение при 691 мМ по отношению к чистому реактиву. Все определения повторяют трижды. (2) Щелочную активность протеазы определяют применением субстрата денатурориванного гемоглобина. Для этого гемоглобин (0,5 мг) смешивают с дистиллированной водой (10 мл), мочевиной (9 г) и 1

М NaOH (2 мл) и выдерживают 1 ч, Затем .прибавляют раствор хлористого кальция (5 мас. $/об.) 1,1 мл) и борной кислоты (1 M+

+7 мМ NaCI, 2,5 мл), устанавливая добавлением HCI рН 7 5, объем доводят до 25 мл добавлением воды и раствор центрифугируют 20 минут при 4000 g, Испытание проводят с использованием полученного субстрата по методике, описанной для кислотной активности протеазы, но использованием в качестве реакционной среды вместо 10 мМ HCI буфера Трис-HCI c рН 7,5. (С) Определение активности химотрипсина/трипсина в тонкой кишке. (1) Частичная очистка протеазы тонкой кишки.

Порошок высушенной птичьей тонкой кишки (500 мг) экстрагируют 30 мин;,1 мМ

HCI (5 мл), Экстрат центрифугируют 30 мин

1837766

14 и и ч с с м м с о б р б л д к н

Ф

Со в н н и т ц х м

P и т

P (1

P к и н к н

Т б к д

В (1

7 х н т д

Ч с

4 С и 22000 g. Полученную жидкую ть пропускают через колонку с сефадекС-50 (360 мм х 15 мм) со средним разром частиц и элюируют 0,5 мМ HCI co ростью 0,7 мл/мин. Фракции (3,5 мл) отают и испытывают на присутствие в них ка по поглощению при 280 нм. Соржащие белок фракции объединяют и центрируют пропусканием через ультиолетовую ячейку (фильтр УМ 30). бранный концентрат во время использоия хранят при 4 С. (2) Определения со специфичными субратами (испытание на этиловый эфир Nетил-1-тирозинахимотрипсин), Субстрат получен растворением ЭЭАТ

0 мг) в буфере Трис-Н С!(рН 7,5), содержаем 30 (об./об,) метанола (25 мл). Активю протеазу кишечника перепела перед пытанием на химотрипсин очищают часчно по вышеприведенной методике. Реакю проводят в кварцевой кювете (1 х 0,25х смз), заполненной субстратом (1 мл) и 100 буфером Трис-HCI (200 мкл). Начинают акцию добавлением частично очищенной отеазы кишечника (200 мкл) и затем конолируют по уменьшению поглощения при

7 нм в течение 5 мин. Все определения вторяют трижды по отношению к пустому агенту.

Испытание на этиловый эфир N-бензо-1-аргинина (ЭЭБА) (трипсин снегиря).

Субстрат получают растворением ЭЭБА

0 мг) в смеси 50 мМ буфера Трис-HCI с рН

5 (24 мл) с 5%-ным (мас,/об.) раствора хлостого кальция (1 мл). Активную протеазу шечника снегиря частично очищают по иведенной методике перед испытанием активный трипсин. Реакцию проводят в арцевой кювете (1 х 9,35 х 1 cMз), заполнной субстратом (1 мл) и 50 MM буфером ис-НС! (200 мкл). Реакцию начинают довлением частично очищенной протеазы шечника (200 мл), после чего 7 мин наблюют уменьшение поглощения при 253 нм, е определения проводят трижды по отноению к холостому реагенту.

Испытания на метиловый эфир N-и-тоолсульфонил-1-аргинина (МЭТА) (пепсин лубя).

Субстрат получают растворением МЭТА

9 мг) в смеси 100 MM буфера Трис-HCI с рН

5 (50 мл) с 5%-ным раствором (мас./об.) ористого кальция (2 мл), Протеазу кишечка голубя перед испытанием на активный ипсин частично очищают по вышепривенной методике. Реакцию проводят в кварвой кювете (1 0,25 х 1 см ), заполненной бстратом (3 мл) и 100 мМ буфером TpucCI с рН 7,5 (100 мкм). Начинают реакцию

55 добавлением частично очищенной протеазы кишечника (100 мкл), после чего 5 мин наблюдают за уменьшением поглощения при

247 нм. (Д) Ингибирование активности химотрипсина/трипсина, Воспроизводят описанные методики испытания на ЭЭАТ, ЭЭВА и МЭТА, но с добавлением к субстрату одного из ряДа соединений формулы (i) или для сравнения одного из соединений альтернативной группы, причем концентрацию соединения доводят либо (а) до 1 х 10 М (испытание на

ЭЭАТ и ЭЭВА) добавлением в 100 мМ буфер

Трис-HCI с рН 7,5 (100 мкл) вместо 200 мкл того же буфера, смешанного в кювете с субстратом, либо (с) до 60 мкг/мл добавлением при 2 мг/мл в 100 мМ буфер Трис-HCI с рН

7,5 (100 мкл), которые прибавляют к 100 мкл того же буфера, уже имеющегося в наличии.

Однако, как при испытании на химотрипсин, так и трипсин контрольный опыт проводят с

200 мкл буфера, не содержащего добавляемого соединения.

Результаты, полученные для химотрипсина перепела и трипсина снегиря, приведены в табл.1 и табл.1(а) — для трипсина голубя, где представлены цифры, показывают процент ингибирования по сравнению с активностью в контрольном опыте с учетом станда ртн ых отклонений (и = 3) (и рочерк указывает, что рассмотренное соединение не испытывалось на трипсин снегиря из-за наличия этого препарата в ограниченных количествах), Пример 2. Опыты с кормлением японского перепела. (A) Самок японского перепела в возрасте шести недель подготавливают и взвешивают за семь дней до опыта с кормлением.

В каждую из четырех клеток сажают птиц и птицы в каждой клетке получают различное питание, в том числе (а) контрольное питание, представляющее собой стандартное рыхлое питание начального откорма индеек (ПНОИ), (в) ПНОИ), обработанное 5000 ч-млн циннамида, (с) ПНОИ, обработанное

5000 ч/мин, 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричной кислоты и (d) ПНОИ, обработанное

2500 ч/млн циннамида 1 2500 ч/млн 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричной кислоты. В каждом случае ПНОИ готовят растворением/суспендированием соединения или соединений в диэтиловом эфире (1500 мл) и смешиванием с ПНОИ (2000 г) при концентрации 0,25% или 0,5% (масс/масс.) соединение/ПНОИ, Смешивание проводят в промышленном смесителе в течение 1 ч с последующим испарением дэтилового эфира и получением однородной смеси. Конт15

1837766

16 рольное питание получают смешиванием

ПНОИ (2000 г) с диэтиловым эфиром в промышленном пищевом смесителе в течение

1 ч. В ходе 14 дней ежедневно отмечают количество потребленной в каждом случае пищи и прибавку в весе птицами. Опыт проводят с дублированием.

Результаты опытов представлены в табл.2 вместе со стандартными отклонениями, Из табл,2 видно, что питание (в) и (d) приводит к уменьшению прибавки веса по сравнению с контрольным питанием (а), Необходимо отметить, что повышенное потребление пищи, видимо происходит в случае питаний (с) и (д), может быть результатом компенсации по отношению к ингибированию фермента и соответственно снижению ценности потребленной пищи, (В) В качестве варианта опытов, описанных в разделе (А), в каждую иэ четырех клеток помещают по четыре перепела и обитателям каждой клетки предлагают на выбор контрольное питание ПНОИ и ПНОИ, обработанное: (а) 5000 ч/млн циннамида, (в)

2500 ч/млн, циннамида, (c) 100 ч/млн циннамида и (в) 2500 ч/млн циннамида250 ч/млн 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричной кислоты, Каждое питание приготовляют способом раздела (А).

Результаты опытов приведены в табл.3 вместе со стандартными отклонениями. Из табл.3 видно, что в каждом случае птицы потребляют меньше обработанной, чем необработанной пищи и что, хотя прибавка в весе была наименьшей длг птиц, которым предлагалось контрольное питание+ 5000 ч/млн. циннамида, тем не менее меньше всего потреблялось питание, обработанное 2500 ч/млн. циннамида

+ 2500 ч/млн, 4-гидрокси-3,5-диметоксикоричной кислоты.

Пример 3. Опыты с кормлением диких голубей.

Диких голубей переводят иэ общей голубятни на свежем воздухе в отдельные клетки и содержат при цикле: 10 ч света—

14 ч темноты. Птиц постепенно отлучают от обычного питания, состоящего из зерен кукурузы, пшеницы и тины болотной, и переводят на стандартное лабораторное питание из таблетированного начального рациона для откорма индеек. Все птицы теряют в весе в первые несколько дней привыкания к новым условиям, Большинство начинает восстанавливать вес через 3 или 4 дня, Отдельные птицы не могут приспособиться, продолжают терять вес и их исключают из эксперимента, Спустя две-три недели вес птиц более или менее стабилизируется, и тогда приступают к опытам.

Птиц испытывают с рядом соединений формулы (I), а также с октаацетатом сахароэы и диметилантранилатом, которые, как известно, неприятны птицам. Испытуемое соединение в каждом случае растворяют в смеси ацетона с водой (80:20 об./об.) и полученным раствором опрыскивают таблетированный начальный рацион для откорма индеек до концентрации 0,5 мас.$/мас.

Таблетки сушат в печи и затем их оставляют для поглощения атмосферной влаги. Контрольное питание опрыскивают тем объемом смеси ацетона с водой.

Группу из 35 диких голубей рассаживают в отдельные клетки и на них проводят испытания восьми соединений формулы (!), а также октаацетата сахарозы и диметилантранилата, известных птичьих репеллентов, Каждая птица получает каждое соединение в случайном порядке с ограничением по правилу латинского квадрата, Каждое кормление птиц проводят с вариантом беэ выбора и в варианте с двумя выборами, Фаза беэ выбора продолжается 3 дня, в течение которых птицам предлагается единственная кормушка с 120 г обработанной пищи. Каждую птицу взвешивают до и после фазы выбора,, также как и количество оставшейся пищи. После этого сразу следует фаза с двумя выборами, в ходе которой птицы могут выбирать между пищей, обработанной определенным химикатом, и кормушкой, наполненной во всем идентичной таблетированной пищей, но без химиката (a контрольном кормлении используют две кормушки с таблетированной пищей, обработанной смесью ацетона с водой, и одну иэ кормушек произвольно выбирают в качестве контрольной). Фаза с двумя выборами продолжается четыре дня, в ходе которых ежедневно контролируют потребление пищи. Положение кормушек меняют ежедневно с целью преодоления подмены предпочтения к пище предпочтением к. ее местоположению, В ходе опыта птицы в достаточном количестве получают воду и крупнозернистый песок.

Полученные в трехдневном испытании без выбора данные представлены в табл,4, где приведены средние значения потребленной в ходе испытания пищи, в граммах, а также средние значения в весе птиц в граммах после испытания Ilo сравнению с весом до испытания, после каждой цифры приведены стандартные отклонения. Иэ табл,4 видно, что наиболеее заметное снижение потребления пищи по сравнению с контрольным питанием, а также среднее значение разницы в весе наблюдается в случае 3,5-диметоксикоричной кислоты, но осо17

1837766 б нно в случае циннамида, с которым разн ца в весе даже больше, чем в случае с о таацетатом сахарозы и диметилантранил том.

Полученные в четырехдневном испыта-,5 н и с кормлением при двух выборах данные и едставлены в табл.5 в виде потребления . о работанной пищи в среднем. Из табл.5 в дно, что в согласии с испытанием кормлен ем без выбора обработанная 3,5-диме- 10 т ксикоричная кислотой и особенно ц ннамидом пища потребляется s наименьш м количестве, в частности, даже меньше, ч м обработанная диметилантранилатом и ща, 15

П р и ме р 4. Полевые испытания в груш вых садах.

Коричная кислота и 3,4-дигидроксикор чная кислота испытана в полевых услови-. ях на способность отпугивать снегирей от 20 ск евывания развивающих почек грушевых д ревьев. Уровень повреждения контролиру т в двух промышленных садах с раннего ф враля по апрель путем регулярного подсч та склеванных снегирями почек в стан- 25 д тном образце, имеющем 50 почек. После то о как повреждение достигло умеренного ур вня, в каждом саду выбирают 20 деревьев для экспериментального опрыскивания, и ти деревья находятся в полосе, находя- 30 щ йся в нескольких метрах от того края сада s котором примерно 10-20"-,ь почек по реждено. Часть каждого дерева, имеющ ro в среднем 250 почек, и затем подсчиты ают урон, который сравнивают с уроном 35 (а) ругой части того же дерева и (в) соседних не прысканных деревьев. В первом саду пр меняют коричную кислоту (25 г в смеси ац тона с водой (80;20 об./об.), которую нано ят с помощью ранцевого опрыскивателя, 40 а во втором саду наносят в том же количестве и тем же способом 3,4-дигидроксикоричну кислоту. Для обоих соединений спустя

1 не елю проводят повторное опрыскивание.

Полученные результаты суммированы в 45 та л,6, из которой видно, что в первом саду ур н частям деревьев. опрысканных корично кислотой, был значительно меньше по ср внению с другими ветвями того дерева (pe ультаты после двух опрыскиваний). Во 50 втором саду прослеживается та же закономерность, но в гораздо меньшей степени и с более сильным проявлением при сравнении с соседними деревьями, чем с неопрысканными ветвями того же дерева, Со временем наблюдается пропадание эффекта, заключающегося в избегании птицами опрысканных ветвей, что связано с потерей почками остатков соединения, и это более заметно для 3,4-дигидроксикоричной кислоты, по сравнению с коричной кислотой (остаточное процентное содержание от начального уровня через 8 дней составляет

8 для 3,4-дигидроксикоричной кислоты, в то время как для коричной кислоты оно составляет 41 через 8 дней и 3, спустя 51 день). Однако проведенные испытания указывают на потенциал этих соединений в борьбе с птицами, Формула изобретения

Применение в качестве птичьего репеллента одного или более соединений форму ы! XzXT Rl Rt

X с-с-Y

l 1

XX)R, Rq где Х> и Xs каждый в отдельности выбирают иэ водорода и С -С4-алкила, галогена и галоидэамещенных алкильных групп с 1 — 4 углеродными атомами, Х2, Хз, Х4 каждый в отдельности выбирают из водорода и С1-С4алкила с 1-4 углеродными атомами, окси, алкоксигруппы с "— 4 углеродными атомами и феноксигруппы;

R> и Rz каждый в отдельности выбирают из водорода и алкильных групп с 1 — 4 углеродными атомами;

Яз и R4 — каждый водород или вместе образуют вторую связь углерод-углеродной двойной связи, соединяя — СВ Яз- и -Сйрй4-;

У вЂ” - карбамоил или карбамоил, замещенный одной или двумя одинаковыми или различными алкильными группами с 1 — 4 углеродными атомами, или соединения формулы! выбирают иэ 3,4-диметоксикоричной кислоты и ее сложных эфиров и солей и дополнительно из амида коричной кислоты.

1837766

Таблица 1

Ингибирование.активности химотрипсина перепела/трипсина снегиря

Ингиби ование активности

Соединение

Т ипсин син

64+

43+3

36 1

22

94

13 14+1

2+2

Т а б л и ц а 1 (А) Ингибирование активности трипсина голубя

Соединение

Ингиби ование активности

93+3

22 й1

16+1

14+1

16+4

3 +.1

64+3

9 2

Таблица2

Опыты с питанием без выбора

Коричная кислота

Коричный альдегид

Циннамид а-метилкоричная кислота а-метилкоричный альдегид

Цинннамонитрил

Коричный спирт

Гидрокоричная кислота

4-гидроксикоричная кислота

3-гидроксикоричная кислота

3-метоксикоричная кислота

3,4-дигидроксикоричная кислота

3,4-диметоксикоричная кислота

3,5- диметоксикоричная кислота

3,4,5-триметоксикоричная кислота

4-гидрокси-3,5-диметоксикоричная кислота

Фенилуксуснэя кислота

Бензойная кислота

4-гидрокси-3,5-диметоксибензойная кислота

Коричная кислота

Циннамид

3,4-дигидроксикоричная кислота.

3,4-диметоксикоричная кислота

4-гидрокси-3-диметоксикоричная кислота

3,4;5-триметоксикоричная кислота

4-гидрокси-3,5-диметоксикоричная кислота

3-(3,4-дигидроксициннамоил) хинная кислота

Ингибитор белого трипсина яиц индеек

Диметилантранилат

32М

57 +4

5+1

36 +3

1 7:И)

23+1

20 -6

19 -3

12 +1

43+2

56="4

85+2

83="3

63 ="1

88+2

1837766

22

Таблица 3

Опыты с питанием с выбором

Испытание кормлением без выбора

Средняя разница в весе (г) Соединение

Потребленная пища в среднем (г) 59,8,4

60,4 +3,1

22,3+2,7

1,7 +0,8

2,4= -1,1 — 16 2й1 3

63,3ф3,0

2,3 +1,1

55,3+2,3 — 1,1 +0,9

33,1 1,5 — 12,0+1,2

54,5+2,9

53,0,1 — 0,2й1,1 — 1,5 0,9

60,2 3,3

54,0,6

45,9 Ì,9

2,3 +0,9

2,3 +0,9 — 4 8+2,0

Таблица5

Испытание с кормлением при двух выборах

Соединение

Потребление обработанной пищи в среднем г

Контроль

Коричная кислота

Циннамид

3,4-дигидроксикоричная кислота

3,4-диметоксикоричная кислота

3,4-диметоксикоричная кислота

4-гидрокси-3-метоксикоричная кислота

3,4,5-триметоксикоричная кислота

4-гидрокси-3,5-диметоксикоричная кислота

) Октаацетат сахарозы

) Диметилантранилат

К

К

Ц

3, ло

3, ло

3, ло

4на

3, ки

4ри

О

Д (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (1 (1 нтроль ричная кислота ннамид

-дигидроксикоричная киса

-диметоксикоричная киса

-диметоксикоричная киса идрокси-3-метоксикоричкислота ,5-триметоксикоричная лота идрокси-3,5-диметоксиконая кислота аацетат сахарозы метила нтранилат

42,3 Ì,8

252+ 9

6,0 +.1,5

31,1 -3,4

27,1: 2,8

12,1 «-1,7

22,7,4

19,8+2,7,.".

29,2 M++2,8

28,6,4

18,2+2,4

1837766

24 таблицаб

Полевые испытания

Число деревьев из 20 с меньшим уроном и значиДень после последнего опрыскивания

Наносимое соединение Число опрыскиваний мостью 1 по сравнению с соседниые2и по сравнению с неопрысканными е евьями

14/29 БО

13/20 БО

3,4-дигидроксикоричная кислота

13/20 60

10/20 БО

БΠ— без опрыскивания (1) Значимость определяют биноминальным односторонним критерием, и уровень значимости изменяется в порядке ь**> *ь > ь > БО. Как полагают, относительно низкий. наблюдаемый уровень значимости частично связан с небольшим числом использованных деревьев, Саста вител ь А. Максимов

Редактор 3,.Ходакова Техред M.Moðãåíòàë Корректор В Петраш

Заказ 2873 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5,Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Коричная кислота

Коричная кислота

Коричная кислота

Коричная кислота

3.4-дигидрокоричная кислота

16/20

11/20 60

17/29 ь*+

14/20 БО

11/20 БО

9/20 60

11/20 БО

9/20 БО

14/20 БО

1!/20 БО

15/20 *

10/20 БО