Способ стерилизации лидазы

 

OIIHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИ3

К ПАТЕНТУ

4сгЦ аХЕНТЫ L>i r

ЬЭ

С0

Ch

ЬЭ

ОО

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4939073/1 4 (22) 220531 (46) 30.1 0.93 Бюл. Na 39-40 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи (72) Стекольников Л.И.; Самойленко И.И.; Рыльцев

В.В„Вирник P.Á. (73) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имН.Ф.Гамалеи РАМН (54) СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЛИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии. Цель (19) Щ (11) 2001628 С1 (51) 5 А61Ь2 00 А61Ь2 08 изобретения — снижение дозы ионизирующей радиации, уменьшение концентрации радиопротектора и сохранение активности фермента Способ стерилизации лидазы включает растворение фермента в воде, добавление к раствору радиопротектора и стерилизацию раствора ионизирующей радиацией. В качестве радиопротектора используют мексамин в процентном отношении к массе лидазы

1 — 5, а стерилизацию осуществляют при дозе радиации 5 — 10 кГр.

2001628

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к медицине.

Известен способ стерилизации лидаэы путем фильтрации водных растворов фермента через систему осветляющих и стерилизующих асбестовых фильтров.

Недостаток известного способа заключается в его длительности, а также в том, что при стерилизации происходит потеря значительных количеств фермента (до 20%), адсорбирующегося на асбестовых пластинах.

Известен способ стерилизации лекарственных веществ с помощью ионизирующей радиации, Однако при стерилизации под действием образующихся свободных радикалов также происходит деструкция лекарственных веществ и снижение или подавление их специфической активности.

Известен способ предотвращения разрушения ферментов под действием стерилизующих доз ионизирующей радиации с помощью радиопротекторов — аминоэтилизотиурония, нембутана натрия. цистамина, NazSzOg или аланина. Однако такой способ требует использования высоких концентраций радиопротекторов (15 — 20% к количеству фермента) и не гарантирует отсутствия накопления токсических веществ. возникающих при радиолизе воды.

Наиболее близким к предложенному способу является способ стерилизации фармацевтических препаратов, в том числе ферментов, согласно которому стерилизацию водных растворов препаратов осуществляют ионизирующей радиацией, а перед стерилизацией добавляют в качестве радиопротекторое многоатомные спирты. преимущественно маннит.

Недостатком известного способа является необходимость использования высоких доз ионизирующей радиации (25 кГр). высоких концентраций радиог ротекторое (16% к массе стерилизуемого объекта). а также накопление в растворах продуктов разложения маннита-маннозы и фруктозы и снижение активности ферментов, Целью изобретения является снижение дозы ионизирующей радиации при стерилизации водных растворов лидазы, уменьшение концентрации радиопрстектора и сохранение активности фермента.

Поставленная цель достигается тем, что при способе стерилизации лидазы, включающем растворение фермента в воде, добавление к раствору радиопротектора и стерилизацию раствора ионизирующей радиацией, в качестве радиопротектора используют мексамин в процентном отношении 1-5 к массе лидазы, а стерили5

c,(55 эацию осуществляют при дозе радиации 5—

10 кГр.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предложенный способ отличается от известного иными приемами стерилизации водных растворов лидаэы, в результате чего достигается полная стерильность растворов и сохранение активности фермента. Таким образом, изобретение соответствует критерию "существенные отличия", Анализ известных решений показывает, что совокупность существенных признаков, заявленных в предлагаемом изобретении, в известных технических решениях обнаружена не была. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявленного технического решения критерию "новизна".

Испол ь зова ние в п редложен ном способе стадии и параметры процесса стерилизации являются логически обоснованными.

На фиг. 1 приведены хроматограммы лидазы (1), мексамина (2) и комплекса лидаза-мексамин (3); на фиг. 2 — спектрометрические кривые растворов лидаэы (1) и лидазы

+ мексамина (2); на фиг. 3 — антибактериальное действие комплекса мексамин-лидаэа (на культуре Е, coli АВ 1157, где А — до облучения,  — после радиационной обработки (10 кГр) (1 — лидаза, 2 — мексамин, 3— лидаза + мексамин, 4 — раствор Hz0 (1%)— контроль; на фиг. 4 — то же, на культуре Ps.

aeruginosa 102.

Известно, что в водных растворах белковых веществ, подвергаемых гамма-облучению, протекают деструктивные радиолитические процессы, приводящие к инактиеации белков. Одним иэ основных процессов является их дезаминирование, которое может быть выражено следующей системой уравнений:

РОО 1-НOz - ROOН+О

ROOH--HzO - ROH+HzOz

PCONHC(OH)Rz RCONHz+RzCO

RCONHz+Hz0 -+ ВСООН+ИНз

Введение радиопротекторов предотвра:.цает эти процессы и способствует сохранению акгивности ферментов, Однако ни один из известных протекторов не защищал е пол. ой степени водные растворы лидазы от разрушения при гамма-стерилизации.

Иная картина наблюдалась при использовании в качестве радиопротектора препарата мексамина, являющегося по химической природе хлпридгидратом 5-метокситриптамина

Н (.0 .-, СН2СН МН

Н мексамин.

2001628

10

Выбор этого соединения объясняется его известными радиоэащитными свойствами и высокой реакционной способностью. Можно полагать, что при взаимодействии лидазы с мексамином в водном растворе образуется новое комплексное соединение возможно эа счет реакции аминогрупп мексамина с карбоксильными или другими функциональными группами молекулы фермента.

При этом не исключено, что происходит блокирование наиболее уязвимых фрагментов макромолекул фермента радиопротектором и преграждается доступ к его каталитическим центрам молекулярного кислорода, оказывающего повреждающее действие.

Факт образования такого комплекса был подтвержден в результате хроматографического и спектрального излучения растворов лидазы и мексамина (см, фиг. 1 и 2), где было зарегистрировано изменение величин Рт и абсорбционных кривых в УФ-области спектра.

При стерилизации водных растворов лидазы в отсутствии радиопротектора происходит прогрессирующая потеря активности фермента в зависимости от дозы излучения. При использовании дозы 25 кГр активность лидазы снижается на 30 от исходной величины, а при снижении дозы до 10 кГр — на 15 — 20 . Оптимальное действие мексамина в качестве протектора имеет место при его концентрации 1-5 к массе лидазы. В этом случае особенно отчетливо проявляются не только радиозащитные свойства мексамина, но и выявляется синергическое бактериостатическое или бактерицидное действие комплекса лидаза— мексамин в отношении Е. coll u Ps.

aeruginosa (см. фиг, 3 и 4), Пример 1. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды из расчета 64 усл. ед/мл, раствор фильтруют для удаления механических примесей и к фильтрату (степень контаминации 3,8 10 кол/мл), добавляют 1 г (1 к массе лидазы) мексамина. Смесь перемешивают до полного растворения мексамина и подвергают облучению на изотопной облучательной установке (Со) мощностью дозы 10 кГр/ч

60 при дозе радиации 5 кГр, Препарат лидазы после радиационной обработки сохраняет активность 64 усл. ед/мл.

Контроль стерильности облученных препаратов проводили путем посева на плотную питательную среду (МПА) и в стандартную жидкую тиогликолевую среду. Установлено отсутствие микробной

55 контаминации обработанного препарата как на плотных, так и на жидких питательных средах. Стерльный препарат разливают в асептических условиях по 1 мл и сублимируют. Полученный препарат удовлетворяет требованиям фармакопейной статьи на лидазу (ФС 42 — 2606 — 88).

Пример 2. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды из расчета 64 усл. ед/мл, раствор фильтруют для удаления механических примесей и к фильтрату (степень контаминации 3,4 10 кл/мл) добавляют 2,5 г (2,5 к массе лидазы) мексамина. Смесь перемешивают до полного растворения мексамина и подвергают облучению на изотопной облучательной установке (оСо) с мощностью дозы 10 кГр/ч при дозе радиации 7,5 кГр. Получают полностью стерильный раствор лидазы активностью 64 усл. ед/мл, который разливают в асептических условиях во флаконы по

1 мл и сублимируют. Полученный препарат удовлетворяет требованиям фармакопейной статьи на лидазу (ФС 42-2606-88), Пример 3, 100 r ацетонированного порошка субстанции лидаэы активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды из расчета 64 усл. ед/мл, раствор фильтруют для удаления механических примесей и к фильтрату (степень контаминации 3,1 10 кл/мл) добавляют 5 г (5 к массе лидазы) мексамина, Смесь перемешивают до полного растворения мексамина и подвергают облучению на изотопной облучательной установке (гоСо) с мощностью дозы 10 кГр/час при дозе радиации 10 кГр. Получают полностью стерильный раствор лидазы активностью 64 ед/мл, который разливают в асептических условиях во флаконы по 1 мл и субл им ируют. Полученный препарат удовлетворяет требованиям фармакопейной статьи на лидазу (ФС 42 2606 — 88).

При изменении заявленной совокупности существенных признаков положительный эффект не достигается, что подтверждается сравнительными примерами 4 — 9, Пример 4. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что перед стерилизацией мексамин не добавляют. Получают раствор лидазы, в котором уровень контаминации составляет 2,4 10 кл/мл, а активность ферг мента 54 усл, ед/мл, Пример 5. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью

2001628

7 2

Puz. 7

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что вместо мексамина добавляют 1 r хлоргидрата цистеамина (HSCHzCHzNHz HCl). Получают раствор лидазы, в котором уровень контаминации составляет 0,4 10 кол/мл, а активность фермента 56 усл. ед/мл.

Пример 6. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы с активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что добавляют 0,5 г мексамина (0,5 ь к массе лидазы). Получают раствор, в котором уровень контаминации составляет

0,2 10 кол/мл, а активность лидазы — 50 усл. ед/мл.

Пример 7. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что добавляют 6 г мексамина (6 к массе лидазы). Получают полностью стерильный раствор лидазы активностью 64

Формула изобретения

СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЛИДАЗЫ путем растворения фермента в воде, добавления к раствору радиопротектора и стерилизации раствора ионизирующей раусл/ед/мл, что свидетельствует о нецелесообразности повышения концентрации мексамина в растворе.

Пример 8. 100 г ацетонированного

5 порошка субстанции лидазы активностью

256 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что доза радиации составляет

2,5 кГр, Получают раствор лидазы с уровнем

10 контаминации, близким к исходному (5,0х х10 кол /мл).

Пример 9. 100 г ацетонированного порошка субстанции лидазы активностью

25 усл. ед/100 мг растворяют в 4 л воды и

15 далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что доза радиации составляет

15 кГр. Получают полностью стерильный раствор лидазы с расчетной активностью (64 усл, ед/мл), что свидетельствует о неце20 лесообразности повышения дозы радиации. (56) Заявка Великобритании М 2222081, кл. А 61 К 41/00, 1990.

25 диацией, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности фермента, в качестве радиопротектора используют мексамин в процентном отношении 1 - 5 к массе лидазы, а стерилизацию осуществляют радиацией п ри дозе 5 - 10 кГр, 02

Р,/

ФС/Я Г

2001628

Составитель il. .лекольн кое

Техред М. 1Лоргентал I орректор М. Самборская

Редактор А. 6ер

Заказ 3140

Тираж Подписное

НПО "Поиск Роспатента

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производ . вен о здательскии, ок бинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101