Способ получения @ - лактамного антибиотика

 

()») К((())) 2200 5»0 С1 (51) Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ :;" ;,:;- »,,", "

К ПАТЕНТУ (21) 4938838/13 (22) 15.04.91 (46) 15.12.93 Бюа М 45-46 (71) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (72); Ларионов Г.М„Орлова Т.П„Британова АЛ. (73) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ P — ЛАКТАМНОГО

АНТИБИОТИКА (57) Использование: медицина, микробИологическая промышленность дпя получения антибиотиков.

Сущность изобретения; культуральную жидкость обеззараживают формалином, отделяют микробную массу, проводят четырехкратную сорбцию балластных веществ из нативного раствора апьбуминовоцеллюлозным конъюгатом в соотношении коньюгат

-: нативный раствор 4: 1000. Нативный раствор подкисляют до рН 70 и экстрагируют диэтиловым эфиром. Антибиотик извлекают путем двухщ>атной сорбции таким же коньюгатов эпюируют ацетоном и после отгона растворителя лиофилизируют, 2табл.

2004590

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к производству антибиотиков Р-лактамов, и может быть использовано при выделении из культуральной жидкости и очистке как антибиотика этого класса, синтезируемого P.pseudomallel, так и других -лактамов, о которых известно, что они обратимо связываются с белками, не инактивируются при рН 9,0 в течение времени, необходимого для доведения реакции нативного раствора до рН 9,0 и растворимы в ацетоне.

Известно, что бактерии рода

Pseudomonas проявляют антагонизм в от.ношении многих аидов микроорганизмов, обусловленный способностью к синтезу разнообразных по структуре антибистических веществ в том числе j3 -лактамов (Fournier J., Chambon L, 1 a melioidose et

bacille de Whitmore//Collection de Instltut

Pasteur. Ed. JAed. — Paris, 1958; Айзенман

Б.Е, Антибиотические свойства бактерий.—

Киев: Наукова думка, 1973, — С. 21 — 40; Смирнов B.Â., Киприанова Е,А, Бактерии рода

Pseudomonas — продуценты новых антибиотиков//Пробл. изыскания и биотехнол. новых антиботиков. Всесоюз, конф., Москва, 22 — 24 июня 1982. Тех. докл, — Пущино, 1982. — С.54 — 55; Кожыбски Т., Ковшик-Гиндифер

3., Курылович В. Антибиотики. Происхождение, природа и свойства; В 2-х томах, — Варшава: Польск, гос. мед, изд-во, 1969. — Т,2,—

С,905 — 916; Патент Великобритании А 61 К

21/00 ¹ 3505237, Способ получения антибиотиков при помощи Pseudomonas роИапсИ; Патент Японии С 12 О 9/20 N 54—

28473. Способ получения антибиотика BN68; Патент Великобритании С 12 О 9/20 №

2006750. Антибиотик BN-213, способ его получения и лекарственные препараты на

его основе; Ланчини Д., Паренти Ф, Антибиотики. Пер. с англ, — M,; Мир, 1985, — С. 16, Смирнов В.В., Киприанова Е,А. Бактерии рода Pseudomonas — продуценты новых антибиотиков//Механизмы синтеза антибиотиков. Отв. ред-ры Г.К, Скрябин, С.М.Навашин. — M. Наука, 1986, — С. 149161; Фомина И.П., Навашин С,M. Современные пенициллины — перспективы развития проблемы//Там же, — С, 92-102; Воробьева

Л.И, Техническая микробиология, — М,: Издво Моск. ун-та, 1987. — С, 140 и другие), Большинство известных антибиотиков псевдомонад синтезируется 20 видами из более чем 200, описанных в литературе. Однако, хотя способность к продукции антибиотиков псевдомонадами известна давно, исследована в этом направлении лишь небольшая часть видов этого рода, а выделе5

40 ние антибиотиков проводилось лишь у нескольких видов.

О способности патогенной псевдомонады Pseudomonas рзеобогпаИе! (так называется этот микроорганизм в настоящее время. Прежние важнейшие синонимы:

Bacillus pseudomallel. 1913; Pleifferella

pseubomallei 1927; Malleomuces

pseudomallel, 1939; Pfelfferella Whitmori, 1949) продуцировать в окружающую среду антибиотик широкого спектра действия известно из сообщения J.Å.Jameson, 1949 (An аntibiotlc from P feif fere lla Whltmorl//J. Hyg „

1949. — К47. — Р. 142 — 145). Этот источник информации был указан ранее в материалах заявки как прототип предлагаемого способа. Джеймсон назвал это антибиотик витморином, С тех пор ни зарубежом, ни в СССР никто не пытался получить данный антибиотик, так как продуцент его — сапрофит, патогенный для человека и животных, возбудитель мелиоидоза — опасной инфкционной болезни. По этой же причине низто не пытался определить к какому классу антибиотиков относится витморин, а также новый это антибиотик или уже известный, В настоящее время зарубежные исследователи не признают антибиотическую природу свойственного P. pseudomallel антагонизма против других микроорганизмов (Маукг Н, Pseudomonas mallei und Pseudomonas

pseudomallei//Handb. bakt, infekt. Tieren.B.3, — lena, 1981, — S. 111 — 153; Kanai ʄ

Dejslrlllert S. Review Pseudomonas

pseudomallei and melioidosis, with special

reference to the in Thailand//Japan J.

Med,Sci.Biol, — 1988. — V, 41. — P. 123 — 157). В обзорной отечественной литературе об антибиотических веществах, синтезируемых псевдомонадами, работа Джеймсона не упоминается. Исследование патентной и научно-технической литературы по антибиотику P.pseudomallei с момента обнаружения его Джеймсоном, т.е. с 1949 года не выявило сведений об этом веществе и способе его выделения и очистки, Джеймсон, как явствует из его сообщения, пытался выделить обнаруженный им антибиотик P.

pseudomallei двумя способами, соответствующими уровню научных значений тех лет о выделении и о производстве антибиотиков. Но витморин оказался нестабильным. в нативном растворе и попытки Джеймсона выделить его окончились безрезультатно.

Установлено, что витморин имеет значение в экологии, таксономии Р,pseudomallel и дифференцировании ее от близкородственной Р.mallei, т,е, данный антибиотик найдет применение в бактериологической диагностике инфекционных болезней, вы2004590

continuous reactive extraction of bench and

5 зываемых этими псевдомонадами. Оказавшийся более широким, чем указывал Джеймсон, спектр действия витмори на (бактерицидно действует на грэмположительные и грамотрицательные микроорганизмы, в том числе возбудителей опасных инфекций, э также на грибки), его устойчивость в кислой и в щелочной среде и нетоксичность может найти применение в клинической практике.

Известны три способа выделения и очистки антибиотиков в том числе Р-лактамов из нативного раствора, применяющиеся как в отдельности, так и в комбинации друг с другом: экстракция и ри разной величине рН в несмешивающиеся с водой органические растворители; сорбция при помощи различных сорбентов: активированного угля, силикагеля, сефадексов, кремнезема, ионообменных смол; осэждение сухими хлоридом натрия, сульфатом аммония, свинцовой, медной, железной, кобальтовой, никелевой, марганцевой, кадмиевой, ртутной солями, щелочами, молочной кислотой, новокаином и другими соединениями при различной степени насыщения (Бражникова M.Ã. Принципы выделения и очистки антибиотических веществ//Успехи соврем, биологии. — 1950 — T. 29, — N3. — С. 360-369;

Гров Д., Рендалл У. Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков. Пер. с англ. — М.: ИЛ, 10; 1958, Гаузе

Г.Ф. Пути изыскания новых антибиотиков,—

M., Изд. АН СССР, 1958, Шемякин M M., Хохлов А.С., Колосов M.Н. и др, Химия антибиотиков: В 2-х томах. — М.: Изд. АН СССР, 1961; Антибиотики/Герольд M., Вондрачек

M., Нечасек Я., Доскочил И. Пер. с чешск.—

M. Медицина, 1966; Кожыбски Т„КовшикГиндифер 3., Курылович В. Антибиотики: В

2-х томах. — Варшава: Польск. гос. мед. издво, 1969; Навашин С.М„Бринберг С.А., Былинкина Е,С. Производство антибиотиков.—

М,: Медицина, 1970; Егоров Н.С, Основы учения об антибиотиках. — М.: Высш. шк., 1986;

Пат. М 4440751, США; Пат N 4456592, CLLJA;

Заявка ДЕ N. 3304785 Al, ФРГ; Пат. С 12 D

9/02, 13/00 М 52 — 18275, Япония; Пат. С 12 P

35/06 М 58-17594, Япония и многие другие).

Известные способы в связи с сложностью и трудоемкостью процессов выделения и очистки антибиотиков, в том числе

Р-лактамов, требуют для своего осуществления больших затрат труда, материалов, различных приспособлений, аппаратов и приборов, дополнительных реагентов, многозтапности (например, заявка С 12 P 35/06

N. 58-17594, Япония; Penicillin recover by

pilot plant-scale eguipment/Reschke М„

Mulier B„Wittier R. et а! inst, Techn. Chem„

Univ. Наллочег, DB//3 Eur. Congr.

Biotechnol.. Munchen, 10 — 14 Sept, 1984.— I/ol.1, — P.631-635; Авт, свид, С 12 P 1/06 М

1589628 Al и другие), так как не обеспечивают сами по себе высокий выход чистых антибиотиков с использованной массы нативного раствора.

Все указанные недостатки известных способов присущи и способам, примененным Джеймсоном при попытке выделить из нативного раствора антибиотик витморин, и родуцируемый патогенной Pseudomonas

pseudomallei (Pfeifferella Whitmori — см. второй абзац на 2-ом листе данного описания).

Джеймсон использовал два известных в то время способа: сорбцию на активированном угле с последующей элюцией (десорбцией) метанолом и ацетоном и экстракцию н-бутанолом. В принципе эти старые способы выделения и очистки Р-лактамов предлагается использовать и в настоящее время, например, в заявке С12Р 35/06 N 58-17594, Япония и в множестве других, а также в научно-технической литературе по выделению и очистке Р-лактамов (пенициллинов и цефэлоспоринов), Однако пропускание нативного раствора через колонки с активированным углем приводит к плохой сорбции антибиотика в результате забивания пор сорбента балластными компонентами нативного раствора, что в результате практически приводит к низкому выходу целевого продукта, большим потерям его и делает выделение и очистку искомого вещества невозможными без дополнительных приемов, трудовых и материальных затрат, предотвращающих это явление или компенсирующих его. Кроме этого, большинство Р-лактамов и, как показали наши опыты, в том числе витморин слабо связываются cдругими обычно используемыми или предлагаемыми в патентах сорбентэми: силикагелями. сефадексами, ионообменными соединениями различной структуры, кремнеземом, т.к. P -лактамы не образуют прочных химических связей со всеми сорбентами, достаточных для выделения. В результате сорбция Р-лактамных антибиотиков известными сорбентами малоэффективна и трудоемка.

Бутаноловый экстракт витморина, как и других Р -лактамов, например, ампициллинэ, карбенициллина, кефзола плохо отделяется от нэтивного раствора. что также приводит к низкому выходу целевого продукта и к загрязнению его балластными веществами. Экстракция этих антибиотиков

2004590

30

45

55 другими органическими растворителями, в том числе, например, диэтиловым эфиром при предварительном подкислении нативного раствора до рН, равного 0,1: 0,5; 1,0;

2,0; 3,0; 4,0 и т.д. до рН 7,0 при одно- и трехкратном использовании экстрагента давала в наших условиях низкий выход антибиотика, незначительно зависимый от количества повторных экстракций, Выход продукта, близкий к 50% от его содержания в нативном растворе, обеспечивала только

10-кратная последовательная экстракция эфиром при рН 0,1 нативного раствора. Для выделения витморина экстракционным способом требовалось наличие многообъемной вытяжной вентиляции, больших объемов экстрагента и многократных повторных экстракций, специальных противопожарных мероприятий, В процессе работы по получению витморина опробованы практически все известные способы выделения антибиотиков, указанные при характеристике аналогов. В результате антибиотик витморин был получен экстракционным (диэтиловый эфир при рН 0,1) и сорбционным (на активированном угле) способами с очень низким выходом, Изучение физико-химических и биологических свойств витморина, его функциональных групп и хромофоров позволило идентифицировать его как смесь шести производных Р -лактама цефалоспориновой группы с необычным для j3-лактамов свойством-активность против грибков, в том числе возбудителей глубоких микозов.

Анализ патентной литературы по способам выделения и очистки Р -лактамов не выявил ничего нового по сравнению с теми способами, которые были известны и которые мы уже использовали для выделения и очистки витморина. Низкий выход конечного продукта, достигаемый при помощи известных пособов (см, таблицу после примеров конкретного выполнения в материалах заявки), побудил к поиску способа, простого. менее трудоемкого, не требующего дополнительного оборудования, а главное — обеспечивающего более высокий выход антибиотика и повышение его чистоты. Кроме того, необходимо было найти методический прием, обеспечивающий из-за патогенности продуцента витморина для человека и животных полную безопасность культурального бульона этой псевдомонады при работе с ним по выделению и очистке продуцируемого этим микроорганизмом антибиотика, Этот методический прием для обеззараживания культурального бульона должен был по логике быть полезным для самого процесса выделения и очистки витморина, т.е, каким-то образом сочетаться с последующими манипуляциями .по получению антибиотика. Использовавшийся для обеззараживания бульонной культуры продуцента витморина хлороформ не сочетался с выделением антибиотика, так как витморин в хлороформе не растворим, Согласно способа, примененного Джеймсоном; нативный раствор получают после обеззараживания бульонной культуры

Р,pseudomallei путем быстрого, в течение нескольких минут (из-за термолабильности витморина в жидкости) прогревания ее до

100 С или в течение 10 мин при 75 С и отделения бакмассы центрифугированием или зейтцфильтрацией.

Однако это практически невозможно осуществить быстро с большими объемами бульонной культуры, необходимыми для выделения и очистки антибиотика, т.к. требуется масштабного соблюдения режима безопасности в процессе работы, что требует в свою очередь специальной защитной одежды, специального оборудования, аппаратуры и дополнительных производственных площадей для их размещения, т.е. больших материальных затрат, Кроме того, такую манипуляцию для получения нативного раствора невозможно осуществить быстро из-за большой теплоемкости больших объемов культуральной жидкости, а это отрицательно влияет на активность целевого продукта.

Известны способы обеззараживания бульонных культур патогенных микроорганизмов (например, особенности методических приемов при работе с возбудителями инфекционных болезней человека1и II ãðóïпы патогенности бактериальной этиологии:

Практическое руководство/Уралева В.С„

Гулида M.Ì„Ëåáåäåâà С.А. и др. — Ростовна-дону, 1989, — С,75; Инструкция о противоэп идем ичес ком режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных болезней!-II групп. — Саратов, 1979. — С. 59-83), Однако в этих руководствах, а также в патентной и научно-технической литературе нет сведений, характеризующих влияние известных деэинфектантов на активность антибиотиков класса Р --лактамов при контакте с ними.

Известно, что все Р-лактамные антибиотики имеют s своей структуре свободную карбонильную группу C=Q в Р-лактам2004590

10

55 ном кольце (Химия антибиотиков/Шемякин

М,M.. Хохлов А.С„Колосов М.Н. и др. — М,:

Изд. Ан. СССР, 1961; Франклин Т., Сноу

Дж. Биохимия антимикробного действия;

Пер, с англ. — M. Мир, 1984. — С.56 и другие), а антибиотическая активность их связана с лабильностью лактамного кольца, в частности с реакционноспособностью амидной группы, замыкающей это кольцо, которая состоит иэ карбонильной группы„углерод которой связан с азотом бывшей аминогруппы (Указанные выше монографии; Якубке Х. — Д. Ешкайт Х, Аминокислоты.

Пептиды. Белки. Пер. с нем. — M. Мир, 1985, — С. 298)..

Известно, что свободная карбонильная группа .«=0 сильно поляризована, что обусловливает большую реакционную способность органических соединений, содержащих карбонильную группу; Для этой группы характерна реакция присоединения (Терней А, Современная органическая химия: В 2-х томах. Пер. с англ. — M.: Мир, 1981. — Т.2. — С. 5-6. 26-27; Хомченко Г.П. Химия . (для подготовительных отделений): Учебник, — M.: Высш. шк. 1988. — С. 325-326;

Практикум по органической химии, Синтез и идентификация органических соединений. Под ред, О.Ф.Гинзбурга и А.А.Петрова. — М.; Высш. шк., 1989, — С. 124-127 и другие).

Известно, что карбоксильная группа. имеющаяся в боковых цепях не только ф-лактамных антибиотиков, не проявляет . характерные свойства .карбонильной группы (Они же. Там же; Гончаров А.И., Корнилов М.Ю Справочник по химии. — Киев:

Вища шк., 1977. — С. 120 и другие).

Известно, что наиболее обширным классом соединений, которые вступают в реакцию присоединения с веществами, содержащими карбонильную группу, являются производные аммиака. Продукт реакции этого типа — имин или основание Шиффа типа <(=gp достаточно устойчив, чтобы его можно было выделить (Терней А.

Там же. — С. 27-28; Марч Дж. Органическая химия, Реакции, механизмы и структура. Углубленный курс для университетов и химических вузов: В 4-х томах. Пер. с англ. — M.:

Мир, 1987. — Т.З. — С.340 — 342).

Известно, что вещества с реакционноспособной карбонильной группой — альдегиды и кетоны непосредственно реагируют со свободными аминогруппами (производное

45 аммиака) белка также с образованием относительно стойких оснований Шиффа (Полевая О.Ю., Ковалев И.Е. Принципы синтеза конъюгированных антигенов//Хим. - фарм. ж. — 1978. — Т. 12. — N 2. — С. 8-22 и другие).

На основании этих известных фактов и их сопоставления предположили, что для Рлактамов, в структуре которых. имеется свободная карбонильная группа в амидной связи р -лактамного кольца, должна быть характерна реакция присоединения, свойственная альдегидам и кетонам, т.е. эта группа у Р-лактамных антибиотиков должна быть сильно поляризована и. вследствие этого, реакционноспособна.

Известно, что связывание белками многочисленных лекарственных веществ обусловлено взаимодействием полярных групп этих веществ с полярными или ионными группами белков (Гауровиц Ф. Химия и функции белков: Пер. с англ. — М.; Мир, 1956.—

С. 281).

Известно, что большинство антибиотиков связывается в различной степени с белковыми веществами (Гров Д., Рендалл У.

Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков: Пер. с англ. — М.:

Медгиз, 1958 — С. 18).

Известно также, что это свойство антибиотиков наиболее выражено у Р-лактамов (Фомина И.П., Навашин М.М. Современные пенициллины — перспективы развития проблемы//Механизмы биосинтеза антибиотиков. Отв, ред-ры Г.К.Скрябин, С.М.Навашин, — M.: Наука, 1986. —.С, 92-102 и др.). Для иллюстрации этого свойства Р-лактамов приводят свободную таблицу, характеризующую процент связывания белками сыворотки крови Р -лактамов группы пенициллинов, составленную на основании данных табл.1 и 2, приведенных в обзоре

Фоминой И,П. и Навашина С.М., на который только что сделали ссылку.

Комплексирование белков с различными биологически активными компонентами в процессе жизнедеятельности органиэма— широко известное явление. Наиболее реакционноспособным белком крови является альбумин (Гауровиц Ф. Химия и функции белков: Пер. с англ. — М.: Мир, 1965, С. 178, 218, 280 и другие). У больных, получавших большие дозы пенициллина на электрофореграммах сывороточных белков появляется быстрый компонент альбумина, .исчезающий из крови после прекращения терапии. Этот феномен проявляется in vitro при добавлении к сыворотке крови 500000

Ед/мл натриевой соли пенициллина (Arvan

2004590

5

0.А Biumberg В.S., Melartin L.//Cliï. Chlm.

Acta. 1968. — V. 22. — P. 21 — 25), Известно, что молекула пенициллина или цефалотина образует соединение амидного типа между карбонильным атомом углерода — лактамного кольца и е МНр-группой остатков аминокислоты лизина молекулы альбумина. Этот процесс не является ферментативным. Образовавшаяся ковалентная связь обладает довольно значительной прочностью (Levine В,В. New.

Enge. J,Med, — 1966. V. 275, — P. 1115), Диализ уменьшает количество связанного альбумином пенициллина или цефалотина, .т.е. эта связь является обратимой. Фермент

Р-лактамаза не гидролизует P лактам, соединенный с альбумином (это подтверждают и результаты наших опытов),.

В процессе излучения физико-химических свойств антибиотика витморина, полученного изестными способами (сорбцией на активированном угле и экстракцией диэтиловым эфиром при рН 0,1), было установлено, что это антибиотическое вещество способно связываться с сывороточным альбумином, в качестве которого использовали сначала альбумин, который мы выделяли из нормальной лошадиной сыворотки (дешевое сырье), а затем коммерческий бычий сывороточный альбумин (БСА). В дальнейшем выявили, что 4%-ный раствор БСА способен связывать 87,5% витморина от количества его в одном литре исходного раствора.

Известно, что молекула альбумина, например, БСА, содержит 60 свободных Я-аминогрупп аминокислотных остатков лизина (Goldfarb Я,R. Biocim. blophys. Acta. — 1970, V. 200, — Р. 1 — 4, Ковалентное связывание этаперазина с белком для получения антител, нейтрализирующих физиологическое действие этаперазина/Полевая О.Ю., Башарова Л,А., Шайдров B.B„Êoâàëåâ

И, Е.//Хим,-фарм. ж, — 1976, — Т. 10 — N- . 9.—

С, 15 — 19). Эта величина теоретически характеризует сорбционную емкость альбумина в отношении связывающихся с ним Р-лактамов(пенициллинов, цефалоспоринов,монобактамов и всех других Р-лактамных антибиотиков как уже известных, так и открытых в будущем). Практически, как показали результаты проведенных опытов, сорбционная емкость молекулы сывороточного альбумина в отношении P лактамов зависит от наличия в молекуле антибиотика в его боковых цепях других радикалов и их величины, создающих пространственные трудности (стерические затруднения -Марч

Дж, Органическая химия. Реакции, механизмы и структура. Углубленный курс для ун-TOB и химич. вузов: В 4-х томах: Пер. C англ, — M. Мир„1987) для сближения и последующей реакции между карбонильным углеродом Р -лактамного кольца того или иного j3-лактама и свободными -аминогруппами молекулы альбумина, По этой причине все Р -лактамные антибиотики связываются с молекулой альбумина с разной интенсивностью. Поэтому каждый Р -лактам характеризуется конкретным, только ему свойственным процентом связывания (что видно из приведенной выше таблицы) с сывороточными белками, а именно с альбумином.

Известно также что деэинфектант формальдегид модифицирует функциональные группы белка. Сразу же после добавления формальдегида в раствор белка происходит быстрое его взаимодействие с аминогруппами белка, в частности альбумина (Гауровиц Ф, Химия и функции белков: Пер. с. англ.

M.: Мир, 1965, — С. 179 — 180; Оценка различных количественных методов определения белков, нативных и ообработанных формальдегидом/Кондакова Н,В., Божко Г,B., Коржова Л.П., и др,//Вопросы мед. химии. — 1983, — Т.1. — В.2. — С.134 — 140). При этом местами атаки формальдегида в белках могут быть первичный и вторичный азот алифатических аминокислотных остатков, в том числе остатков лизина, азот пептидной связи, азот имидазольного кольца гистидина и индольного — у триптофана, Н- и ОН-группы боковых цепей, а также по реакции нуклеофильного замещения о-положение фенольного кольца тирозина и а-С-атом индольного кольца триптофана. В результате модификации белка формальдегидом

"разрыхляется" пространственная организация белковой молекулы и становятся доступными другие ее функциональные группы. Модифицированный формальдегидом белок, в том числе альбумин может быть затем регенерирован диализом (Они же.

Там же), B опытах, проведенных с беззараженным формальдегидом культуральным бульоном P.pseubomallei, содержащим витморин— смесь дериватов Р-лактамов цефалоспориновой группы, было обнаружено, что альбумин после контакта с содержащимся в нативном растворе формальдегидом, лучше, интенсивнее связывает содержащиеся в растворе балластные вещества, от которых было практически невозможно освободить полностью целевой продукт при сорбции его активированным углем или при экстрации его органическими растворителями, В результате этой серии опытов было установлено, что балластные соединения

2004590

55 полностью удаляются из нативного раствора бычьим сывороточным альбумином, модифицированным формальдегидом при четырехкратной сорбции их альбуминовоцеллюлозным конъюгатом, взятым в соотношении к нативному раствору 4:1000 при рН

9,0, При этом искомый P лактамный антибиотик витморин практически не связывался с модифицированными формальдегидом функциональными группами белка, что предотвращало потери целевого продукта при получении его предлагаемым способом и тем самым повышало в несколько раз его выход.

Таким образом, полученные в этих опытах результаты позволило испольэовать формальдегид в качестве средства, обеззараживающего культуральный бульон патогенного продуцента P лактамных антибиотиков P.pseubomallei, средства, консервирующего нативный раствор и тем самым предотвращающим частичную инактивацию в нем витморина, которая происходила в ходе длительной сорбции его активированным углем при пропускании раствора антибиотика через колонки с углем, а также модификатора функциональных групп альбуминового сорбента, способствующего своим воздействием на функциональные группы альбумина в совокупности с доведением реакции нативного раствора до рН 9,0 резкому повышению масштабности связывания балластных соединений с альбумином сорбента, что играло важную роль в получении чистого целевого продукта. Последующую сорбцию самого витморина проводили после доведения рН освобожденного от балластных соединений раствора антибиотика, до 7,0 и удаления из раствора остатков формальдегида экстракцией диэтиловым эфиром (чтобы предотвратить воэмо>кную модификацию формальдегидом свободных аминогрупп белка сорбента), В качестве средства, десорбирующего связавшийся с альбуминовым сорбентом

Р-лактам, были испытаны разные органические растворители, В результате в качестве десорбента был выбран ацетон, который, являясь простейшим кетоном, имеет в своей структуре как и Р-лактамы реакционноспособную карбонильную группу, более активную, чем у Р-лактамов, и, видимо, поэтому вытесняет последние иэ аддукта. образующегося в результате реакции присоединения к карбонильной группе лактамных антибиотиков аминогруппы белка. Такой механизм реакции между продуктами реакции присоединения, свойственной альде5

35 гидам,метилкетонам и некоторым циклическим кетонам (а лактамы можно рассматри-. вать по своей структуре и как циклические кетоны), и другими альдегидами и кетонами описан в химической литературе (например, Терней А, Современная органическая химия: В 2-х томах. Пер. с англ, — M,: Мир, 1981. — Т.2. — С, 25 — 26 и другие), Кроме того, ацетон хорошо растворяет многие j3-лактамы, легко отгоняется под вакуумом при

30 — 32 С и менее ядовит по сравнению с другими использованными растворителями. Преимуществом ацетона является и тот факт, что в нем не растворяются аминокислоты нативного раствора, которые в принципе могут быть захвачены массой сорбента при манипуляциях с ней при получении Р-лактамов. Это свойство ацетона, известное из справочной литературы по химии, положительно сказывается на чистоте целевого продукта.

Альбуминово-целлюлозный сорбент, а не свободный альбумин, использовали для получения Р -лактамных антибиотиков для того, чтобы белок, связавший антибиотик, можно было легко отделять от раствора, содержащего антибиотическое вещество. Эта задача была решена путем изготовления и применения водной взвеси альбуминовоцеллюлозного конъюгата. Конъюгат готовили на основе известного факта связывания карбонильных групп диальдегидцеллюлозы с аминогруппами альбумина и стабилизации образовавшейся между белком и целлюлозой ковалеткой связи боргидридом натрия, Все зти известные факты послужили основой для разработки нового способа выделения антибиотиков, имеющих

Р-лактамное кольцо в структуре своей молекулы.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан способ получения Р -лактамных антибиотиков, позволяющих значительно увеличить выход и чистоту целевого продукта, в том числе антибиотика витморина, продуцируемого

P.pseu dome llei. Способ дешевый. т, к. может быть осуществлен с использованием альбумина животных, для получения которого может быть использовано дешевое сырье— кровь животных, забиваемых на мясокомбинате любого крупного города.

В принципе предлагаемым способом можно получать любые j3-лактамы иэ бульонной культуры любого их продуцента, т,к. все Р-лактамы образуют обратимую химическую связь с е-аминогруппами альбуми2004590

15

Вид эон подавления роста St.aureus 209 нативным раствором — HP после каждого удаления из него балластных соединений

f»g

2 й/ гидридом натрия химической связи, образовавшейся между альбумином и целПосле извлечения иэ нативного раствора балластных соединений, его готовили для связывания альбуминово-целлюлозным коньюгатом только антибиотика. Для этого раствор нейтрализовали соляной кислотой и трижды экстрагировали диэтиловым эфиром для удаления остатков формальдегида.

Антибиотик извлекали при помощи 4 двух сорбций коньюгатом при тех же параметрах, что были изложены выше. Сорбент с связавшимся с ним антибиотиком быстро отмывали на центрифуге водой от остатков нативного раствора. Антибиотик десорби- 4 ровали ацетоном, который затем отгоняли.

Жидкий остаток после отгона ацетона лиофилизировали. У конечного продукта — сухона независимо от того каким продуцентом синтезированы Р-лактамные антибиотики.

Пример 1. Выращенную в бульоне

Хоттин гера р Н 7,5-7,6 пятисуточную культуру Pseudomonas pseudomallel обеэзараживали добавлением фоомалина до 1 -ной конечной концентрации с экспозицией не менее 12 ч при комнатной температуре. Hýтивный раствор отделяли от микробной массы декантацией.

Для удаления балластных соединений из нативного раствора его подщелачивали, стремясь к наименьшему разбавлению. при помощи концентрированного водного рас.твора гидроксида натрия до рН 9,0 и четыре раза сорбировали альбуминово-целлюлозным коньюгатом из расчета 4 г его по сухому весу на 1 л, каждый раэ выдерживая смесь сорбента с раствором 24 ч при комнатной температуре, периодически (5-6 раз в течеwe рабочего дня) перемешивая ее.

Альбуминово-целлюлоэный сорбент в виде водной взвеси готовили путем коньюгациии в щелочной среде коммерческого бычьего сывороточного альбумина с взвесью окисленной перйодатом в альдегидную форму порошковой коммерческой . или полученной из хлопковой ваты химически чистой целлюлозы, стабилизации борлюлозой, отмывки готового сорбента от следов реактивов водой.

Для контроля за очисткой антибиотика от балластных соединений, связывающихся

5 при рН 9,0 в присутствии формалина с альбуминово-целлюлоэным сорбентом, после каждой сорбции их и удаления вместе с сорбентом, отбирали пробы жидкости одинакового обьема, например 5 мл, 10 нейтрализовали их концентрированной conwoh кислотой и три раза экстрагировали из них диэтиловым эфиром остатки формальдегида. Затем пробы лиофильно сушили и сухой остаток растворяли в 0,1 мл

15 дистиллированной воды. У полученных растворов проверяли активность в отношении микробов-индикаторов данного антибиотика: $1.аагмз 209 или Y,pestls ЕВ НИИЭГ методом диффузии в агар в лунках. При уче20 те результатов через 24 ч обращали внимание на наличие или отсутствие в зонах ингибиции роста — 1 тест-микробов (см. ниже) окрашенной зоны -2, которую образуют балластные соединения непосредственно

25 вокруг лунки — 3. При этом констатировали, что после каждого удаления балластных веществ диаметр окрашенной зоны уменьшался, а после четвертой сорбции — исчезал, как это показано ниже:

30 го препарата антибиотика определяли вес, который характеризовал выход антибиотика. и проверялась активность и степень чистоты.

Активность растворов, содержащих ан35 тибиотик, определяли в стандартных условиях методом диффузии в агар в лунках как . изложено выше. Величийу активности выражали в условных единицах, предложенных

ВНИИА для расчета активности антибиоти0 ков (Навашин С.М., Фомина И.П. Справочник по антибиотикам. 3-е иэд. — М.:

Медицина, 1974, — С.57), т.е, принимали, что раствор антибиотика с активностью 1

ЕД/мл образует зону задержки роста тест5 микроба диаметром 17 мм. Серией опытов было установлено. что активность 5-суточного культурального бульона штамма P.pseudomallel 5Y361 M-5-8. использован17

2004590

18 г - 4 к t 2,3 19 С, . г2-4К1 in —, Co

40 с, ч = е.:.7

55 ного в качестве продуцента антибиотика, выраженная в мм диаметра зон ингибиции роста тест-микроба St.aureus 209, колебалась в пределах 16 — 18 мм и равнялась в среднем 17 мм, После разведения культурального бульона в 2 раза, активность его снижалась в среднем до 12 мм. При последующем двукратном разведении культуральный бульон не обладал активностью.

Исходя иэ этого, принимали, что нативный культуральный бульон содержит антибиотик в концентрации 1 ЕД/мл. а разведенный вдвое — 0,5 ЕД/мл.

Для определения активности растворов антибиотика в единицах использовали принцип упомянутого выше метода, согласно которому строили стандартную кривую зависимости диаметра эон подавления роста S,aureus 209 от активности испытуемых растворов в единицах. Угол наклона стандартной кривой характеризовался разностью диаметров эон от двукратных концентраций антибиотика, т,е. эон, образуемых цельным культуральным бульоном и разведенным в 2 раза.

Для выявления концентрации раствора антибиотика, обеспечивающей образование принятой единицей активности оптимальных зон задержки роста тест-микроба, использовали известную формулу Купера (Cooper К.Е. In; Analutical Microbiology.—

New Jork, 1962 — Р. 1-85), связывающую размер в см зоны подавления роста тест-микробов с начальной концентрацией антибиотика в лунке в мкг/мл: где: r — радиус эоны в см, к — коэффициент диффузии, см /ч;

t — время диффузии до учета результатов, ч;

Со — концентрация препарата, мкг/мл;

Ct — концентрация препарата в лунке через время to;

In — натуральный логарифм.

Принимая во внимание, что in а = 2,3 lg a (Краткий справочник химика. Составитель

В.И.Перельман. 6-е изд, — M.: ГХИ, 1963.—

С. 570). а величиной Ст можно пренебречь, т.к. эа 24 ч, использовавшиеся в качестве стандартного времени при определении диаметра зон ингибиции, содержимое лунки полностью диффундирует в пластинку агара, и в лунке ничего не остается, формулу

Купера упростили, а затем преобразовали следующим образом:

Р

Отсюда Ig Co =

4 h 2,3 где r — радиус зоны, см;

h — высота стандартной пластинки агара, см, в которой сделана стандартная лунка.

Величину Со находили по таблице антилогарифмов.

Оказалось, что активность в 1ЕД/мл соответствует концентрации антибиотика в

1,7 мкг/мл. Найденное весовое выражение

1 единицы активности препарата использовали также для характеристики степени чистоты (С,Ч,) конечного продукта, Для этого готовили его раствор в воде, содержащий

1,7 мкг/мл полученного антибиотика, и определяли методом диффузии в агар в лунках диаметр в мм вызываемой данным раствором зоны ингибиции роста тест-микроба.

При образовании зоны диаметром 17 мм, препарат считали чистым, т.е. степень чистоты его характеризовали единицей или как

100 . При образовании меньших по диаметру зон испытуемым раствором препарата чистоту его оцени вали по формуле: ДЗлр.—

ДЛ/ДЗ рд — ДЛ, где n3np — диаметр эоны в мм, образовавшейся поддействием испытуемого раствора препарата; ДЗ ед = 17, т.е. зто диаметр зоны, сформированной под действиел1 раствора антибиотика с концентрацией 1,7 мкг/ал, активность которого равна 1ЕД/мл; ДЛ вЂ” стандартный диаметр лунки, всегда равный 7 мм. После подставления уже известных значений формула имела следующий вид

Полученные результаты приведены в сводной таблице после примера 7, Пример 2. Выделение и очистку антибиотика производили как изложено в примере 1, но после удаления из нативного раствора балластных соединений с последующим доведением соляной кислотой реакции раствора до рН 7,0 и удаления остатков формальдегида экстракцией диэтиловым эфиром в соотношении 1:3, извлечение антибиотика производили двукратной сорбцией альбуминово-целлюлозным конъюгатом, который брали в соотношении коньюгат; нативный раствор 2:1000. Характеристика полученного препарата антибиотика представлена в таблице после прил еров.

2004590

Таблица 1

Антибиотик

15-25

15-20

15-25

50-60

50

20-30

93

15-25

Ампицилин

Азлоциллин

Амоксициллин

Бакампициллин

Бензилпенициллин

Диклоксацилин

Карбенициллин

Мезлоциллин

Метициллин

Оксациллин

Пивампи иллин

Пример 3, Получение антибиотика производили как в примере 1, но для извлечения антибиотика альбуминово-целлюлоэный сорбент брали в соотношении сорбент:нативный раствор 5:1000. Характеристика полученного антибиотика по выходу и чистоте представлена в таблице после примеров конкретного выполнения.

Пример 4. Антибиотик получали как описано в примере 1, но для удаления из нативного раствора балластных соединений альбуминово-целлюлозный сорбент брали в соотношении с нативным раствором 2;1000. Выход и степень чистоты полученного антибиотика в этом примере указаны в сводной таблице.

Пример 5. Получение антибиотика осуществляли как изложено в примере 1, но для удаления балластных веществ применяли альбуминово-целлюлозный конъюгат в соОтношении с нативным раствором как

5:1000. Характеристика препарата, полученного в этом примере конкретного выполнения, отражена в сводной таблице, помещенной после примеров конкретного выполнения.

Пример 6, Выделение и очистку антибиотического вещества, продуцируемого в питательную среду псевдомонадами данного вида, производили как изложено в примере 1. Для получения сравнительных данных, характеризующих выход и степень чистоты конечного продукта, параллельно из такого же объема нативного раствора получали антибиотик известным способом— сорбцией активированным углем с последующей десорбцией антибиотика с угля ацетоном, Сорбцию углем проводили .при параметрах, аналогичных параметрам сорбции антибиотика альбуминово-целлюлозным конъюгатом, Параметры десорбции антибиотика с активированного угля ацетоном были адекватны таковым при десорбции этого антибиотика ацетоном с альбуминово-целлюлозного сорбента, Данные, характеризующие полученный известным

5 . способом антибиотик. представлены в сводной таблице.

Пример 7; Получение антибиотика производили как в примере 1, а также известным способом — экстракцией н-бутанолом

10 с последующим отгоном экстрагента и лиофилиэацией остатка. Характеристика антибиотического препарата, полученного известным способом, приведена в следующей табл.2.

15 Сравнительные данные по получению антибиотика различными способами. Исходный материал в каждом примере: 10л нативного раствора с активностью lЕД/мл, содержащих 10 тыс. ЕД (17 мг) антибио20 тика.

Указанные в примере 1 параметры сорбции альбуминово-целлюлоэным конъюгатом как балластных соединений, так и антибиотика, являются оптимальными. Из25 менение их оказывает существенное влияние на выход целевого продукта (примеры 2 и 5), степень его чистоты (пример 4) или проводят к излишнему расходу сорбента (пример 3), т.е. к дополнительным затратам.

30 Использование заявляемого способа получения антибиотика, вырабатываемого

P. pseudomallel, обеспечивает следующие преимущества по сравнению с существующим способом

35 а) позволяет увеличить выход антибиотика в 2,5 и более раз; б) позволяет повысить чистоту конечного продукта без снижения его активности.

40 (56) Jameson J. Е. An antibiotic from

Pfeifferella Whltmori. J. Hyg. 1949, 47, р

142-145, Связывание белками сыво отки, 22

2004590

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Показатель

Способ и тип ввоПриСтепень Примеси в

Потери в

% с отраПотери в .% при димо го сорбента (экстрагента) мер препарате, %

ЧИСТОТЫ целевого проукта удалении ботанным балласт- нативным ных веществ раствором

34,7

1,0

64,7

0,6

1,0

32,0

33,3

34,7 б 4,9

1,0

0.4

34,7

50,0

20,0

0.5

80,0

0,6

19,4

1,0

60,3

38,0

0,6

Такого этапа в способе нет

0,8

13,5

86,5

Известный с н-бутаНОЛОМ

76,0

50,0

-0,5

24,0

Формула изобретения ражива10т формалином, из нативного раствора предварительно удаляют баллаСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ p - ЛАКТАМНО- стные вещества посредством четырехкратГО АНТИБИОТИКА, включающий отделе- ной сорбции альбуми- ново-целлюлозным ние микробной массы, извлечение конъюгатом в соотношении конъюгат: наантибиотика из нативного Раствора путем 1 тивнь1й Раствор 4 : 1000, затем нативный сорбции, элюцию его ацетоном с последу- раствор экстрагируют диэтиловым эфиром ющим отгоном растворителя, отличающий-, при РН 7,00 и осуществляют извлечение ся тем, что, с целью увеличения выхода антибиотика путем двукратной сорбции таантибиотика и повышения его чистоты, пе-, ким же коньюгатом, после чего целевой ред отделением микробную массу обезза- 15 продуктлиофилизируют.

3

5

Заявляемый, альбуминово-целлюлозный сорбент

То же

Тот же

Тот же

Тот же

Известный с активированным углем

Выход цел ввого продукта, % от его содержания в нативном аствО е