Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОЬРЕТЕ Н Ия е Н ПАтЕНтУ

Своз Соеетсиик

Социалистичесюа

Республик (11) 51! 862 (61) Дополнительный к патенту—

1759098/28 — 13/ (22) Заявлено 03.06.74 (21)- /2040658/23 4 (51) M. K .Ñ07 0 501/22 (23) Приоритет 14,03.72 (32) 31.05.71

ГааударвтввннМ квинтет

Ввватв Маннвтреа СССР ае данаи авв5рвтвннв а атнритнй (33) Япония (1) 38143 (53) УДК 547.86.07 (088.8) (43) Опубликовано 25.04.76, Бюллетень Яе 15 (45) Дата опубликования описания 13.12.77, (72) Авторы изобретения

Ииос1ранцы

Дзиносуке Абе, Тацуо Ватанабэ„ Цумому Ямагути, Куние Мацумото и Тадасиро Фудзи (Япония ) Иностранная фирма

"ToNeЪзе Компани Лтд " (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-АМИНОДЕЗАЦ@ТОКСИЦЕФАЛОСПОРЛНОВОЙ КИСЛОТУ

%СО-М тт

СН

СООМ сн

Йредлагается новый способ получения 7-амино1 дныф»рй кн.(7-ЛДСК)

° обладающей биологической активностью.

Известен химический способ получения 7амииодезапятоксицефалоспораионой кислоты восстановлением цефалоспорииа С в присутствии пвляадированного угля с нослацувтиим деацилироваиием обр ьутощейся 3 - метил 7 -(с 11-аминоадипоиламиц ° Ь ° цефем - 4- карбоновой кислоты, вькод палевого щнщукта до 70%.

Предлагаемый способ представляет собой энзиьавое иояучение 7 - амииоцезацвтоксицефалосиораионой киавоты формулы

° Ю»

l и отличается тем, что, с целью увеличения выхода тввлевого продукта, водорастворимув саа 7 - аце иламинодезацетокснцефалоснорановоЩ кислоты, общей формулы где R - бензильная нли феноксиметнльная группа 1

М - атом щелочного металла, обрабатывают энзнмным препаратом штамма Вас i

lus megater ium В-400 F EM-P 1т 748, продуцирующего !

5 энз - а но дролазу цет д энзим сор. бнруют на носителе, не ннактивирующем этот энзнм, добавляют к этому носителю водный раствор 7 - aMmc дезацетоксицефапоспорановой кислоты и нз реакционной массы выделяют целевой

М продукт. Энзнм, снос сбнын разлагать амццную связь, получают аэробным выращи чнием Bacillus

regaterium В-400 FEM-P Р 748 при 25-37 С в течение 12 — 60 час в питательной среде, содержащей соответствующие количества источников азота, ис26 т яннков углерода и неорганические соли. В качест511862 ве носителя используют целит, силикагель, активированный уголь, его количество при периодическом способе работы составляет предлочтительно

5.15 вес.% от количества филь|рата культуры, Энзим. иую реакцию проводят, как правило, на колонке, количество непрореагировавшей 7 - ациламинодезацатоксицефалоспорановой кислоты в выходящей реакционной жидкости составляет обычно

0,5-1,Овес,%. Целевой продукт выделяют известньяя способом с выходом до 89%.

Пример 1.

А. 20 л aoatwoÀ культуральной среды (рН 7,0), содержащей 1% полипептона, 1% дрожжевого экстракта и 0,5% хлористого натрия, загружаютв чашечный ферментатор на 30 л и стерилизуют в течение 20 мин паром при 120 С. Затем в стерильных условиях переносят в эту культуральную среду 200мл затравочной культуры Bacillus megatarium В-400 FEPM- P У 45, которую выращивают при 30 С в течение 24час в культуральной среде указанного состава и фермеитируют при 30 С в течение 48 час с азрацией и перемешиванием при рюахода воздуха 20 л/мин (скорость мешалки

300o6/мин). По окончании ферментапии клетки удаляют с помощью центрифуги-сепаратора Вестфалия и получают 17,4 л фильтрата культуры.

Б. Фильтрвт культуры упаривают до 1/3 объеьва при иаруяаой температуре 30 35 С и в концентрат добавляют сульфат аммония до достижения 80% яасыщения. Вьиввшяй осадок растворяют в дистиллированной воде и обессоливают на колонке с сефадексом С-25. Обессолеиный раствор вымори. кивают и получают 24,3 г стандартнси.о энзимного продукта В. рН 1О л полученного филътрата культуры Ва.

cillus megaterium В-400 FEPM-Р Н 748 доводят до

7 с 1юмощью уксусной кислоты. К филътрату культуры добавляют 500 r диатомитовой земли и полученную смесь перемешивают в течение 30 мии.

В течение этого времени постоянно поддерживают рН 7, Затем реакционную жидкость центрифугируют на центрифуге корэинчатого типа, затем промывают водой.

П р и í е р 2. рН фильтрата кулътуры Вас(11ив

2Å

10

megater lum В-400 ГЕРМ-P 11е 748, полученной в . 45 пример1Б, доводят до значения7. К каждому литру филътрвта отдельно . добавляют по r- 50 г цалита "(Гифло Супер 1Ьл) ", активированного угля (фирмы "Вако Джищяки Ко", для хроматографии), СМ-целлюлозного иоиообменннка (фирмы ",Серва Ко", 0,52 мкг/г) и амберлита СС-50 (форма Н), полученные смеси перемешивают в течение 30 мин. В это время рН поддерживают около 7, затем каждый носитель выделяют фильт55 рованием, промывают водой и получают влажный носитель. Рассчитывают степень энзимной адссрбции для каждого носителя, принимая за 100% ную адсорбцню энэима степень адсорбции целмтом, при этом получают результатьь приведенные в табл. I.

Таблица1

Относительная степень адсорбцни,%

Носитель

11елит

Активированный уголь

СМ-целлюлоза

Амбе лит СС-50

81,2

Пример 3, Целит с сорбированным днацилирующим знзимом (энзимный титр 1800 ед/г), полу. ченный в примере 2, промывают буферным раствором 0,01М фосфата (рН 7,5), набивают в колонку, снабженную рубашкой (5 х 50 см) и промывают в течение 1 час при определенной скорости этим же буферным раствором.

Наружную температуру колонки поддерживают около 37 C. Затем через колонку пропускают 6 и (5мг/мл свободной кислоты) водного раствора натрий 7 - фенилацетамндодеэацетоксицефалоспоpa8aza при определенной скорости, вытекающую жидкость фракционир уют на отдельные фракции (количество каждой фракции 10,8 мл). рН 6,4л элюата доводят до 6 и упаривают до

1/10 объема. Концентрат доводят до рН 3,7 с помощью 6 1ч и. соляной кислоты,при этом образующаяся 7-АДСК начинает выпадать в осадок. Для завершения осаждевсия концентрат охлаждают льдом, осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством ледяной воды, хорошо промывают ацетоном и после сушки получают 14,00 г белой 7-АПСК, т.пл. 240-242 С, выход 72,4%.

Этот продукт растворяют в водном растворе едкого натра (2,5), раствор обесцвечивают активированиым углем, доводят рН до 3,7 с помощью бйн. соляной кислоты и охлаждают льдом для осажденюв 7-АДСК. Затем 7-АДСК отфильтровывают, про. мывают небольипач количеством ледяной воды, промывают ацетоном и сушат, при этом получают

11,4 г очищенного продукта.

П р н м е р 4, Повторяют:пример 3, но вместо целита с ссрбированным деацилирующим знзимом для получении 7-АДСК используют активироваиный уголь с сорбированным энэимом, СМ-целлюлозу с сорбированным энзимом и амберлит CC-50 с сарбщ ованньм энзимом. Получают результаты. приведеннь|е в табл. 2.

511862,Таблица 2

Количество о кта,г

Носитель

Выход,%

Актнвированный уголь

CM- целлюлоза

Амберлнт СС-50

58,2

51,8

48,5

37,5

32,9

31,3

Формула изобретения

Составитель А. Фрегер

Техред М. Левицкая

Редактор О, Кузнецова

Корректор И. Гоксич

3аказ 753/1333 Тираж 576 ft0дни сное цИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

11 3035, Москва, Ж- 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 5. Для получения культуры проводят выращивание, как в црнмере 1. 1 л этой культуры переносят в резервуар для выращивания культуры на 250л, в котором находится 200л среды такого же состава в прнмере1, и ведут выращивание при 30 С в течение 48 час. Для получения 350л культуры (фильтрата) используют 2 резервуара на 250 л. К фнльтрату культуры добав. ляют 3,5 кг целита и смесь перемешивают 30 мин, поддерживая рН среды 7. Затем смесь дегндратируют на центрифуге, остаток промывают водой и получают 5,2 кг влажного целита (энзимный ппр

5000 ед/г). Этот целит помещают в поливинилхлорцдную колонку размером 120х900 мм и через нее пропускают раствор (5 мг/мл) 7-фенилацетамидо. дезацетоксицефалоспорановой кислоты в фосфатном буферном растворе 0,05 М рН 7,5), поддерживая температуру 37 С . Элюированне заканчивают в те-: чение 72 час. и получают всего 375 л элюата. К этому элюату добавляют 290л ацетона, рН полученной смеси доводят до 4,0 бн. соляной кислотой, перемешивают в течение 30 мин и оставляют на ночь для выпадения осад-30 ка. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат, получают 1130,2 r кристаллов 7-AHCA (чистота 90,0%), выход 89,2%.

Способ получения 7 - амннодезацетоксицефал- оспорановой кислоты общей формулы

2 о т л и ч а ю щ н и с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, водорастворимую соль

7 - ациламинодеэацетоксицефалоспорановой кислоты общей формулы CO- NH

О сн

COON где R - базнльная или фенокснметильная группа;

М - атом щелочного металла, подвергают контакту с фвльтратом ппамма

Bacillus megaterium В-400 FEPM-Р У 748, продуцирующего энэим - амнногидроаазу ацетамида, причем укаэанный фильтрат адсорбирован на носителе.