Способ количественного определения -фотопротеина

 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и может быть использовано для изучения транспорта гормонов. Сущность изобретения: инкубация исследуемого образца сыворотки крови с меченым изотопом реагентом, специфически взаимодействующим с a-протеином с образованием комплексов, отделением несвязанного в комплексы реагента и подсчетом радиоактивной фракции, содержащей комплексы. Для упрощения в качестве специфического реагента используют меченый экстрадиол в концентрации 60 нм, а отделение несвязывающегося эстрадиола осуществляют в течение 5 - 10 с. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и может быть использовано в лабораторной практике для количественного определения АФП при изучении транспорта гормонов в крови животных.

Цель изобретения - упрощение известного способа с сохранением его высокой чувствительности, специфичности и точности.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве меченого лиганда используют меченый эстрадиол в концентрации 60 нм, а отделение несвязавшегося в комплексы экстрадиода осуществляют в течение 8-10 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемую пробу сыворотки крови инкубируют с меченым эстрадиолом (2,4,6,7-³Н)-эстрадиол, 100 Ки/ммоль, в насыщенной концентрации. В результате этой реакции каждая молекула АФП образует комплекс с одной молекулой меченого эстрадиола. Насыщенная концентрация определяется предварительно при анализе кривой насыщения специфического связывания меченого эстрадиола в диапазоне 7,5-120 нм и составляет, преимущественно, 60 нм для крысят неонатального возраста при разведении сыворотки 1 : 2000.

Инкубацию проб сыворотки с меченым эстрадиолом в насыщающей концентрации (60 нм) проводят в течение 10 мин при 37^оС на водяной бане, а затем, в течение 1 ч на ледяной бане при 2^оС, проводят отделение несвязанного с АФП эстрадиола адсорбентом, связывающим низкомолекулярные соединения (эстадиол) и несвязывающим крупные молекулы (комплексы АФП-эстрадиол).

В предлагаемом способе используют жестко ограниченный временной интервал для отделения свободного эстрадиола : 5-10 с. Именно, при этом условии достигается насыщение специфического связывания эстрадиола.

Количество АФП в пробе оценивают по уровню радиоактивности фракции, содержащей меченый эстрадиол, который и просчитывают на сцинтилляционном счетчике "Дельта" (США) с эффективностью счета 50% .

Чувствительность способа в значительной степени определяется удельной активностью меченого эстрадиола. При использовании эстрадиола с удельной активностью 100 Ки/ммоль она составляет около 10¹⁵ моль АФП в пробе, или 10^-15 моль/л, что соответствует чувствительности прототипа (0,001 мг/л или примерно 1,4x x10^-11 моль/л).

Специфичность. В настоящее время у крыс не обнаружено белков сыворотки крови, кроме α-фетопротеина, специфически связывающих только эстрогены. В крови некоторых видов животных и у человека обнаружен эстрадиол-тестостерон, связывающий белок, сродство которого к тестостерону примерно такое же, как и к эстрадиолу. У крысят неонатального возраста тестостерон в 1000-кратном избытке не влиял на связывание меченого эстрадиола сывороткой крови.

Для сравнения результатов измерений АФП, получаемых с использованием заявляемого способа по сравнению с радиоиммунным способом было проведено измерение онтогенетической динамики уровня АФП у развивающихся крыс (см. таблицу).

В таблице приведены результаты измерения уровня АФП у развивающихся крыс заявляемым способом и радиоиммунным способом. Из таблицы видно, что характер динамики и полученные по способу абсолютные значения соответствуют данным, полученным с помощью радиоиммунного способа.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Получение кривой насыщения специфического связывания эстрадиола. Исследование проводили на сыворотке крови крысят неонатального возраста, когда содержание АФП максимально в период их постнатальной жизни. Сыворотку крови последовательно разводили в 2000 раз (200 х 10) фосфатным буферным раствором (1,06% -ный Na₂HPO₄ ˙ 2H₂O, 0,37% -ный хелатон, рН 7,4) с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) - 100 мг/100 мл. Меченый эстрадиол [(2,4,6,7-3Н)-эстрадиол, 100 Ки/ммоль, г. Ленинград] в концентрации 7,5; 15, 30, 60, 120 нм инкубировали с 0,1 мл разведенной сыворотки крови без добавления (общее связывание) и с добавлением 20 мкМ немеченого эстрадиола (неспецифическое связывание). Специфическое связывание определяли вычитанием величины неспецифического связывания ³Н-эстрадиола из общего его связывания. Инкубацию проводили в течение 10 мин при 37^оС, а затем 1 ч на ледяной бане (2^оС). Несвязавшийся эстрадиол удаляли суспензией "уголь-декстран" (4% -ный уголь, "Сигма", США; 0,4% -ный декстран, "Сигма" США, мол. м. 60 тыс. - 90 тыс. в фосфатном буферном растворе без добавления БСА). Для этого 0,2 мл охлажденной суспензии (2^оС) приливали одновременно к двум пробам и без встряхивания через 10 с центрифугировали на микроцентрифуге 20-25 с, 0,2 мл супернатанта отбирали на счет в сцинтилляционные флаконы. Чувствительность способа 0,001 мг/л.

П р и м е р 2. Способ количественного определения α-фетопротеина осуществляли аналогично примеру 1 за исключением того, что использовали сыворотку крови беременной крысы и насыщение получено при разведении 1 : 100. Из сыворотки предварительно удаляли эндогенные стероиды суспензией "уголь-декстрон" (равные объемы сыворотки и суспензии смешивали, инкубировали при встряхивании 10 мин при 37^оС и осаждали уголь центрифугированием). Чувствительность 0,001 мг/л. (56) Г. А. Ткачева, М. И. Балаболкин, И. П. Ларичева. Радиоиммунохимические методы исследования. М. , Медицина, 1983.

Формула изобретения

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ α -ФОТОПРОТЕИНА, включающий инкубацию исследуемых образцов сыворотки крови с реагентом, специфически взаимодействующим с α-фотопротеином с образованием комплексов, отделение не связанного в комплексы реагента и счет радиоактивности фракции, содержащей комплексы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве специфического реагента используют меченый эстрадиол в концентрации 60 нм, а отделение не связавшегося в комплексы эстрадиола осуществляют в течение 5 - 10 с.

РИСУНКИ

Рисунок 1