Способ получения изолированных клеток картофеля

 

Использование: биотехнология, клеточная инженерия. Сущность изобретения: изолированные клетки картофеля получают путем обработки листовой ткани ацетатным буфером и мацерирующей смесью, в которую в качестве пектолитического ферментного препарата вводят микробиологически синтезируемую мацеразу С, а в качестве целлолитического - целловиридин ГЗх. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, биохимии, генетической и клеточной инженерии, физиологии растений, в частности к способам получения отдельных клеток растений.

Известен способ получения клеток из ткани листьев табака [1] при использовании ферментного препарата пектиназа-500 в комплексе с ферментом Onozuka R-10 (Serva, ФРГ). Этим методом можно получить до 6 ˙ 10⁶ клеток из грамма сырых листьев.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ обработки пересадочной культуры растительной ткани для проведения цитометрического контроля и получения протопластов [3] Способ заключается в поэтапной обработке растительной биомассы ферментным препаратом Bacillus macerans, обладающим пектат-транс-элиминазной активностью и целлюлазой в течение 4-10 ч при 20-30^оС и 2-4 ч при 22-26^оС при аэрировании и постоянном перемешивании.

Целью изобретения является упрощение и удешевление способа получения изолированных клеток растений картофеля.

Цель достигается тем, что предлагается использовать комплексный ферментный препарат пектолитического действия (мацераза С), продуцируемый бактериями Erwinia chrysanthemi ENA49-5 [2] обладающий пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностями, совместно с целловиридином ГЗх отечественного производства, обработку обоими препаратами проводить в одну стадию, без перемешивания. Выделение изолированных клеток достигается также и тем, что проводится последовательная обработка листовой ткани картофеля в натрий-ацетатном буфере (рН 4,7-4,9) и далее в солевом растворе, содержащем пектолитические и целлюлолитические ферменты без перемешивания при комнатной (18-24^оС) температуре и освещенности 2 ˙ 10³ лк в течение 16 ч. Микроскопический анализ показывает, что в течение 3-4 сут до 60% образующихся клеток сохраняют жизнеспособность и способность к делению.

П р и м е р 1. Фиксированное по весу количество листьев картофеля, нарезанных на полоски шириной 3-5 мм, вносят первоначально в 0,025 М натрий-ацетатный буфер (рН 4,7-4,9) и выдерживают при комнатной (18-24^о) температуре 1 ч. После промывания в 0,01 М Трис-HCl буфере, рН 8,0, листовую ткань помещают в солевой раствор следующего состава, мг/л: сахароза 171000, KH₂PO₄ 27,2; KNO₃ 101,0; MgSO₄ ˙ 7H₂O 246,0; KJ 0,16; CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,025; CaCl₂ 1480,0; рН 5,8, содержащий 0,03 мг/л мацеразы С и 10000 мг/л целловиридина ГЗх. После 16 ч инкубирования при комнатной (18-24^о) температуре и освещенности 2 ˙ 10³ лк, проводят подсчет образующихся клеток в камере Горяева. Эффективность выделения клеток для двух сортов картофеля приведена в таблице.

Данный способ обладает следующими преимуществами: а) возможность исключения импортных ферментных препаратов, которые могут быть заменены отечественными; б) упрощением способа получения за счет совместного использования целлюлолитических и пектолитических ферментов, возможностью проведения процесса при комнатной температуре без перемешивания; в) возможностью получения однородной суспензии, состоящей из жизнеспособных клеток.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК КАРТОФЕЛЯ, включающий обработку листовой ткани в натрий-ацетатном буфере и последующую обработку в мацерирующей смеси, содержащей пектолитические и целлюлолитические ферментные препараты, отличающийся тем, что в качестве пектолитического ферментного препарата используют препарат мацераза С, продуцируемый бактериями Erwinia chrysanthemi ENA 49-5, обладающий пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностью, а в качестве целлюлолитического препарата используют целловиридин ГЗх.

РИСУНКИ

Рисунок 1