Способ культивирования каллусной ткани женьшеня

 

Использование: биотехнология, медицина, фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: каллусную ткань женьшеня культивируют на питательной среде, в которую дополнительно вводят крахмал. 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической, пищевой и косметической промышленности.

Известен способ культивирования каллусной ткани женьшеня-продуцента биологически активных веществ путем посадки инокулюма на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга, культивирования в стандартных условиях и отбора части выросшей биомассы для культивирования на модифицированной питательной среде, из которой затем получают биологически активные вещества, а оставшуюся часть биомассы используют на стадии выращивания инокулятного материала [1] .

Однако этот способ не обеспечивает высокого выхода конечного продукта-биомассы. Кроме того, этот способ дорогостоящий из-за высокой стоимости агара, применяемого в питательной среде.

Наиболее близким по технической сущности является способ культивирования тканей и клеток растений-продуцентов биологически активных веществ, который включает посадку инокулята женьшеня на питательную среду Марасиге и Скуга, в которую дополнительно вносят вещество, способствующее повышению выхода биомассы, культивирование в стандартных условиях, съем биомассы и сохранение части ее для дальнейшего культивирования на этой же среде [2] .

Основным недостатком этого способа является высокая стоимость используемой питательной среды из-за высокой стоимости входящего в него агара, а также низкий выход биомассы.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы и снижение затрат на ее производство.

Для достижения поставленной цели в способе культивирования каллусной ткани женьшеня-продуцента биологически активных веществ, включающем посадку инокулюма на питательную среду, культивирование, съем биомассы и сохранение части ее для дальнейшего культивирования, в питательную среду дополнительно вносят крахмал при следующем соотношении компонентов, мг/л: KNO₃ 1500-2300 NH₄NO₃ 350-450 CaCl₂ ^. 2 H₂O 400-480 MgSO₄ 7 H2O 350-400 KH₂PO₄ 150-190 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ ^. 4 H₂O 15,6-26,7 CoCl₂ ^. 2 H₂O 0,02-0,03 CuSO₄ ^. 5 H₂O 0,02-0,03 ZnSO₄ ^. 7 H₂O 6,0-10,3 Na₂MoO₄ ^. 2 H₂O 0.2-0,3 KI 0,53-0,9 FeSO₄ ^. 7 H₂O 25,3-30,6 Na₂ ЕДТА ^. 2 Н₂О 33,6-41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6 Никотиновая кислота 0,4-0,6 Мезо-инозит 80-120 Казеина гидролизат 80-120 4 Хлорфеноксиуксусная кислота (4СРА) 0,35-0,45 Сахароза 15500-20000 Агар 2000-4000 Крахмал 20000-30000 Дистиллированная вода до 1 л Предлагаемый способ соответствует критерию "существенные отличия", так как в известных способах для повышения выхода биомассы женьшеня и снижения затрат на производство биомассы в составе питательной среды не использовался крахмал при названном соотношении компонентов.

Способ осуществляется следующим образом. В конце цикла культивирования каллусной культуры женьшеня биомассу в закрытой емкости в стерильных условиях перемешивают стерильным инструментом и используют ее в качестве инокулята для пассирования в несколько культуральных сосудов на свежую питательную среду, содержащую крахмал при следующем соотношении компонентов, мг/л: KNO₃ 1500-2300 NH₄NO₃ 350-450 CaCl₂ ^. 2 H₂O 400-480 MgSO₄ ^. 7 H₂0 350-400 KH₂PO₄ 150-190 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ ^. 4 H₂O 15,6-26,7 CoCl₂ ^. 2 H₂O 0,02-0,03 CuSO₄ ^. 5 H₂O 0,02-0,03 ZnSO₄ ˙ 7 H₂O 6,0-10,3 Na₂MoO₄ ^. 2 H₂O 0,2-0,3 KI 0,53-0,9 FeSO₄ ˙ 7H₂O 25,3-30,6 Na₂ ЕДТА ˙ 2 Н₂О 33,6-41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6 Никотиновая кислота 0,4-0,6 Мезо-инозит 80-120 Казеина гидролизат 80-120 4-х Хлорфеноксиуксусная кислота (4 СРА) 0,35-0,45 Сахароза 15500-20000 Агар 2000-4000 Крахмал 20000-300000 Дистиллированная вода До 1 л Культивируют в стандартных условиях в течение 30 сут, в конце цикла культивирования биомассу перемешивают, часть используют для рекультивации (воспроизводство инокулята), а часть для получения целевого продукта-биомассы. На питательную среду высаживают инокулюм массой 2000-2500 мг/60 мл.

П р и м е р 1 (контроль).

а) на стадии приготовления питательной среды: Готовят питательную среду А (табл. 1), разливают ее в культивационные сосуды емкостью по 60 мл в каждый. Закупоренные ватно-марлевыми пробками сосуды стерилизуют в автоклаве при 118^оС в течение 20 мин, рН среды до автоклавирования 5,5-5,8.

б) на стадии культивирования; В застывшую питательную среду в стерильных условиях высаживают биомассу 30-дневных каллусов женьшеня, количество инокулята 2000-2500 мг/60 мл. Инокулюм берут от биомассы, перемешанной стерильным инструментом в стерильной емкости и культивируют в темноте при 24+1^оС и влажности воздуха 50% в течение 30 сут.

в) на стадии рекультивирования: В конце цикла культивирования всю биомассу перемешивают и вновь используют как для получения целевого продукта-биомассы, так и для выращивания инокулята.

При влажности биомассы 7-9% выход по сухой биомассе при шестикратной повторности опыта составил 18,8 г/л; суммарная гликозидная фракция составляет 3,3% .

П р и м е р 2. Способ осуществляется также как в примере 1, но на питательной среде, содержащей крахмал, среда Б. При этом выход биомассы 7-9% влажности при шестикратной повторности опыта составляет 24,9 г/л; суммарная гликозидная фракция составляет 3,9% .

П р и м е р 3. Способ осуществляется как в примере 1, но на питательной среде В. При этом выход биомассы 7-9% влажности при шестикратной повторности составил 23,7 г/л; суммарная гликозидная фракция составляет 4,0% .

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом состоит, во-первых, в том что он позволяет увеличить выход биомассы на 48-50% , при этом содержание гликозидной фракции составляет 3,9-4,0% . Сравнительные данные приведены в табл. 2.

Во-вторых, затраты на приготовление 1 л питательной среды снижаются на 33% , а на получение 1 г сухой биомассы на 44% (табл. 3), т. е. предлагаемый способ значительно дешевле. (56) 1. Авторское свидетельство СССР N 1036053, кл. С 12 N 5/00, 1982.

2. Авторское свидетельство СССР N 1531488, кл. С 12 N 5/00, 1988.

Формула изобретения

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ЖЕНЬШЕНЯ, включающий посадку инокулюма на питательную среду, выращивание и съем биомассы, сохранение части ее для дальнейшего культивирования, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вносят крахмал и выращивание осуществляют при следующем соотношении компонентов питательной среды, мг/л: KNO₃ 1500 - 2300 NH₄NO₃ 350 - 450 CaCl₂ · 2 H₂O 400 - 480
MgSO₄ · 7 H₂O 350 - 400
KH₂PO₄ 150 - 190
H₃BO₃ 4,2 - 8,0
MnSO₄ · 4 H₂O 15,6 - 26,7
CoCl₂ · 2 H₂O 0,02 - 0,03
CuSO₄ · 5 H₂O 0,02 - 0,03
ZnSO₄ · 7 H₂O 6,0 - 10,3
Na₂MoO₄ · 2 H₂O 0,2 - 0,3
KJ 0,53 - 0,9
FeSO₄ · 7 H₂O 25,0 - 30,6
Na₂ · 2 H₂O 33,6 - 41,0
Тиамина гидрохлорид 0,15 - 0,25
Пиридоксина гидрохлорид 0,4 - 0,6
Никотиновая кислота 0,4 - 0,6
Мезоинозит 80 - 120
Казеина гидролизат 80 - 220
4-хлорфенилуксусная кислота 0,35 - 0,45
Сахароза 15500 - 20000
Агар 2000 - 4000
Крахмал 20000 - 30000
Дистиллированная вода До 1 л

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2