Способ выделения ферментного комплекса из культивируемых растительных клеток

 

Использование: в биотехнологии, медицине, пищевой промышленности и косметологии. Сущность изобретения: способ выделения активного ферментного комплекса предусматривает водно-спиртовую экстракцию культивируемых растительных клеток женьшеня или полисциола, деалкоголизацию полученной растворимой фракции гель-фильтрацию деалкоголизированного экстракта на сефадексе (Г 50, Г -75), элюцию комплекса фосфатным буфером рН 6,8 9. Полученный ферментный комплекс может найти широкое применение в медицинской практике в качестве противовоспалительного, радиотерапевтического средства, в онкологии, трансплантологии, а также в пищевой промышленности и ветеринарии. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии. Выделенный ферментный комплекс может найти применение как в медицинской практике, так и в косметологии и пищевой промышленности.

Известно, что в растительном сырье содержатся различные ферменты, в том числе каталаза, пероксидаза и супероксиддисмутаза (СОД). Известны способы выделения СОД [1] пероксидазы [2] Эти способы основаны на гомогенизации сырья, экстракции белков и тонкой очистке на полисахаридных сорбентах.

Эти способы позволяют выделить один индивидуальный ферментный препарат.

Известен способ выделения пероксидазы из растительной ткани полыни, согласно которому листья полыни гомогенизируют в дистиллированной воде в присутствии аскорбата натрия, осаждают белки сульфатом аммония, отделяют осадок фильтрацией и очищают хроматографией на сефадексе G-50 и элюируют фермент [3] Однако этот способ достаточно сложен и позволяет выделить только пероксидазу.

Цель изобретения простыми приемами выделить из биомассы культуры растительных клеток с высоким выходом стабильный комплексный ферментный препарат с высокой биологической активностью.

Цель достигается тем, что из биомассы культуры растительных клеток путем экстракции, центрифугирования, гель-фильтрации выделяют стабильный комплексный ферментный препарат. Причем экстракцию проводят водно-спиртовым раствором с последующей гель-фильтрацией деалкоголизированного экстракта с отбором наиболее активных фракций, полученные фракции объединяют и лиофилизируют. Лиофилизированный препарат оценивают по биологической активности, содержанию белка и иммунотоксичности в сравнении с коммерческим препаратом "Пероксинорм".

Способ осуществляется следующим образом.

П р и м е р 1. К 500 г биомассы женьшеня (штамм ИФРЖ-1) приливают 500 мл, например, 70% -ного пропилового спирта. Смесь гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин, гомогенизат центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин и температуре 20^оС. Надосадочную жидкость деалкоголизируют до полного удаления спирта в пробе.

За процессом выделения ферментного комплекса следят по активности первого фермента CОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составила 50 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл, концентрация белка 4 мг/мл.

20 мл полученного экстракта вносят на колонку (450 x 25 мм) сефадексом Г-75. Элюцию ведут 0,01 М фосфатным буфером рН 8,8. Фракции со средней активностью 18 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрацией белка 0,7 мг/мл объединяют и лиофилизируют.

Потеря антиоксидантной активности фермента составляет около 25% Лиофилизированную пробу анализируют на активность СОД, каталазы и пероксидазы, а также концентрацию белка. Выход белков составляет около 57% от внесенного на колонку. Удельная активность СОД 21,8 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мг белка, каталазы 0,16 мМ H₂О₂/мин˙мг белка, пероксидазы 0,63 усл.опт.ед. Д₄₃₅/мг белка. Концентрация белка 0,7 мг/мл.

П р и м е р 2. К 400 г биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного Polyscias filicifolia Bailey (ВСКККВР N 24) добавляют 700 г 80%-ного, например, изопропилового спирта. Смесь гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. Затем для отделения растворимой фракции центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 20^оС. Осадок отбрасывают. Проводят диалкоголизацию растворимой фракции до полного отсутствия спирта в пробе.

За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого фермента CОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 60 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрация белка 4,5 мг/мл.

18 мл этого экстракта вносят на колонку (450x25 мм) с сефадексом Г-50, элюцию ведут 0,01 М фосфатным буфером при рН 7,0.

Фракции со средней активностью СОД 16,5 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрацией белка 0,6 мг/мл объединяют и лиофилизируют. Потеря активности ферментов составляет около 23% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов: CОД, каталазы, пероксидазы. Удельная активность СОД 18,2 усл. опт.ед. Д₄₆₀/мг белка, каталазы 0,12 мМ H₂О₂/мин ˙мг белка, пероксидазы 0,57 усл.опт.ед. Д₄₃₅/мг белка. Концентрация белка 0,55 мг/мл.

Выход белков суммарно составляет около 58% от внесенного на колонку.

П р и м е р 3. К 500 г биомассы культуры ткани селективного штамма женьшеня 1. Х 13 (ВСКККBР N 26) добавляют 800 г 80%-ного этилового спирта, гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 20^оC, отбрасывая осадок. Растворимую фракцию деалкоголизируют до полного отсутствия спирта.

За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого фермента СОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 80 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрация белка 6 мг/мл.

20 мл этого экстракта вносят на колонку (450x25 мм) с сефадексом Г-75 и элюируют 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2. Фракции со средней активностью СОД 20 усл.опт.ед. Д460/мл и концентрацией белка 0,7 мг/мл объединяют и лиофилизируют.

Потеря активности ферментов составляет около 25% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса: СОД, каталазы и пероксидазы. Удельная активность СОД 20 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мг белка, каталазы 0,143 мМ Н₂О₂/мин˙мг белка, пероксидазы 0,6 усл.опт.ед. Д₄₃₅/мг белка. Концентрация белка 0,57 мг/мл.

Выход белков суммарно составляет около 57% от внесенного на колонку экстракта.

П р и м е р 4. К 500 г шрота от биомассы культивируемых клеток штамма женьшеня ИФРЖ-1 добавляют 500 г 96%-ного, например, этилового спирта, гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. Гомогенизат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 20^оС, отбрасывая осадок. Растворимую фракцию деалкоголизируют до полного отсутствия спирта.

За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого фермента СОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 30 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл, концентрация белка 3 мг/мл.

20 мл этого экстракта вносят на колонку с сефадексом Г-50. Размер колонки 450x25 мм. Элюцию ведут 0,01 М фосфатным буфером рН 6,8.

Фракции со средней активностью СОД 7 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрацией белка 0,4 мг/мл объединяют и лиофилизируют. Потеря активности ферментов составляет около 30% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса. Удельная активность СОД 10 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мг белка, каталазы 0,1 мМ Н₂О₂/мин˙мг белка, пероксидазы 0,3 усл.опт.ед. Д₄₃₅/мг белка. Концентрация белка 0,23 мг/мл.

Выход белков суммарно составляет около 57% от внесенного на колонку экстракта шрота.

П р и м е р 5. К 300 г продукта сырой биомассы штамма женьшеня (ИФРЖ-5) добавляют, например, 80% -ного этилового спирта, гомогенизируют при 6000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре. Гомогенизат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин при температуре 20^оС, отбрасывая осадок. Растворимую фракцию деалкоголизируют до полного отсутствия спирта.

За процессом выделения комплексного препарата по стадиям судят по активности первого ферменте-CОД и концентрации белка. Активность СОД в деалкоголизированном экстракте составляет 68 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрация белка 7,2 мг/мл.

20 мл этого экстракта вносят на колонку (420x25 мм) с сефадексом Г-75, элюируют 0,01 М фосфатным буфером рН 9. Фракции со средней активность СОД 18,5 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мл и концентрацией белка 0,68 мг/мл объединяют и лиофилизурют.

Потеря активности ферментов составляет около 27% Лиофильно высушенную пробу анализируют на активность трех ферментов комплекса CОД, каталазу, пероксидазу.

Удельная активность СОД 20,9 усл.опт.ед. Д₄₆₀/мг белка, каталазы 0,15 мМ H₂О₂/мин˙мг белка, пероксидазы 0,58 усл.опт.ед. Д₄₃₅/мг белка. Концентрация белка 0,59 мг/мл.

Выход белков суммарно составляет около 54% от внесенного на колонку экстракта.

В табл.1 приведено сравнение известного метода выделения СОД и комплексного ферментного препарата. В табл.2 приведены данные СОД, комплексного ферментного препарата "Пероксинорм" и ферментного комплекса, выделенного и культивируемых клеток растений.

Таким образом, предложенная совокупность признаков позволила достаточно просто и быстро выделить комплексный ферментный препарат, который оказался гораздо эффективней и стабильней индивидуального ферментного препарата.

Предложенный способ позволяет получить стабильный ферментный комплекс с определенной биологической активностью, не обладающий иммунотоксичностью, сократить время всех операций на 30% снизить трудоемкость и материалоемкость процесса, повысить в сотни раз выход продукта, который не требует включения других ферментов и может быть использован в качестве субстанции для разработки новых лекарственных форм, косметических препаратов и продуктов лечебного питания.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК, предусматривающий гомогенизацию, отделение балластных белков с получением растворимой фракции ферментов, последующую хроматографию на сефадексе и элюцию, отличающийся тем, что гомогенизации подвергают культивируемые растительные клетки женьшеня или полисциаса после проведения экстракции 70-80% водно-спиртовым раствором, полученную растворимую фракцию деалколизируют, а элюцию комплекса ведут 0,01 М фосфатным буфером pH 6,8 - 9,0, при этом наиболее активные фракции объединяют и лиофильно высушивают.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2