Способ получения билирубиноксидазы

 

Изобретение относится к биотехноло гии, а именно к способу получения фермента билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента - билирубина . Для увеличения выхода фермента, повышения его качества и стабильности в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, которое гомогенизируют в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04% от массы сырья с последующим трехкратным осаждением ацетоном , высаливанием 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6°С в течение 10-12 ч и после растворения осадка диализом против воды. После сушки целевой продукт смешивают с 0,1 -0,2 % глицина. Выход целевого продукта 0,8-1,2% от массы сырья, что в 16-24 раза превышает выход фермента в известном способе, при этом количество расщепляемого билирубина в крови увеличивает на 30-45%, а стабильность фермента возрастает в 8,5 раз при хранении в условиях низких температур. 1 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4782769/13 (22) 12.01,90 (46) 23.11.91. Бюл. ¹ 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт текстильно-галантерейной промышленности (72) Л. И. Стекольников, В. В. Рыльцев и О. Е. Морткович (53) 577.15(088.8) (56) 1. Патент США

N 4600689, кл. С 12 Q 1/26, 1986.

2. Патент США

N 4701111, кл. А 61 К 37/50, С 12 0 1/26.

1987.

3, Yokosuka О Enzymatic oxidation of

biiirubin by intectinal mucosa. — J. Brew, Soc.

Jap., 1988, v, 83, N 2, р, 142-144. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИЛИРУБИНОКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии. а именно к способу получения ферменИзобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения фермента билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента — билирубина.

Известен способ получения билирубиноксидазы азробной ферментацией штаммов грибов Trachyderma tsunodae кл, Basidiomyces на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, при рН 8-9 и 28-45 С в течение 72-96 ч с последующей очисткой культуральной жидкости хроматографией на ионообменных смолах и афинной хроматографией (Ц

„„5Ц „„1693048 А1 (я)5 С 12 N 9/02, А 61 К 37/50 та билирубиноксидазы, катализирующего окисление желчного пигмента — билирубина. Для увеличения выхода фермента, повышения его качества и стабильности в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, которое гомогениэируют в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04%, от массы сырья с последующим трехкратным осаждением ацетоном, высаливанием 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6 С в течение 10-12 ч и после растворения осадка диализом против воды. После сушки целевой продукт смешивают с 0,1-0,2 глицина, Выход целевого продукта 0.8-1,2 от массы сырья, что в 16-24 раза превышает выход фермента в известном способе, при этом количество расщепляемого билирубина в крови увеличивает на 30-45, а стабильность фермента возрастает в 8,5 раз при хранении в условиях низких температур. 1 з.п. ф-лы.

Недостатком способа является его длительность (около 6 сут), а также то обстоятельство, что получаемый фермент расщепляет не более 60 билирубина, что не позволяет гарантировать точность результатов количественного определения небелкового азота и других компонентов в крови и моче.

Известен способ получения билирубиноксидазы путем гомогенизации сырья— плодов высших растений семейств пасленовых и банановых, преимущественно бананов или баклажанов, в водной среде.с последующей фильтрацией гомогената, осаждением фильтрата ацетоном. дополнительным растворением осадка в воде, пере1693048 осаждением из 70%-ного водного спирта и высушиванием целевого продукта (2).

Недостатки известного способа заключаются в необходимости использования пищевого сырья, низком выходе фермента (0,08-0,1 от исходной массы сырья), невысокой его способности расщеплять билирубин (60-65 от содержания в анализируемой пробе) даже при высоких концентрациях (0,15-0,3 мг! мл) и низкой стабильности билирубиноксидазы при хранении (не более 20 сут при 4 С).

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения билирубиноксидазы из гомогената кишечника крыс, основанный на экстракции фермента водой с последующей очисткой фракционированием минеральными солями и органическими растворителями(3).

Недостаток способа заключается в низкой активности фермента, выражающейся в его способности расщеплять лишь 40-50 билирубина, содержащегося в физиологических жидкостях организма, а также в нестойкости билирубиноксидазы (сохранение активности в течение 1-2 нед, в порошкообразном состоянии и в течение 2-4 ч в водном растворе), Целью изобретения является увеличение выхода фермента, повышение его качества и стабильности, Способ получения билирубиноксидазы предусматривает гомогенизацию сырья в водной среде, фильтрацию гомогената, обработку фильтрата ацетоном, дополнительное растворение осадка в воде и сушку, при этом в качестве сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, гомогенизацию проводят в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04 от массы сырья, осаждение ацетоном проводят трижды при 0 С, после растворения осадка в воде полученный раствор обрабатывают равным объемом 6-8 М водного раствора

NaCI при 4-6 С в течение 10-12 ч с последующим диализом раствора против воды. а после сушки целевой продукт смешивают с глицином в количестве 0,1-0,2 от массы целевого продукта.

Пример 1, 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают .на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г индуктора — эфедрина (0,02 от массы сырья), смесь гомогенизируют 1 ч. затем фильтруют; фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденно50 Пример 3. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,4 r индуктора — эфедрина (0,04 от массы сырья), 55 смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды. раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденно10

45 го до 0 С, через 4 4 осадок отделяют, операцию повторяют еще один раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1;1), фильтруют, к фильтратудобавляют равный объем 6M водного раствора NaCI и смесь выдерживают ,при 40С 10 ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4 С 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 8 г порошка билирубиноксидазы (выход 0,8 от исходной массы сырья), к которому добавляют 8 мг глицина (0,1 от массы целевого продукта).

При добавлении к образцу крови с высоким содержанием билирубина (более 20 ммоль/л) фермента в концентрации 0,05 мг/мл происходит расщепление 85 билирубина, Билирубиноксидаэа сохраняет активность при 4 С в течение 2-4 мес, Пример 2. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,3 г индуктора — эфедрина (0,3 от массы сырья), смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С (3 объема от массы сырья), перемешивают, выдерживают при 0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, раствор вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С, через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще один раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1:1), фильтруют, к фильтрату добавляют равный объем 7 М водного раствора NaCI, смесь выдерживают при 5 С 11 ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4 С 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 10 г порошка билирубиноксидазы (выход 1 от исходной массы сырья), к которому добавляют 15 мг глицина (0,15 от массы целевого продукта), При добавлении к образцу крови с высоьим содержанием билирубина (более 20 ммоль/л) фермента в концентрации 0,075 мгlмл происходит расщепление 90 билирубина. Билирубиноксидаза сохраняет активность при 4 С в течение 2-4 мес.

1693048 го до 0 С через 4 ч осадок отделяют, операцию повторяют еще раз, осадок растворяют в 1 л воды (отношение массы исходного сырья и воды 1:1), фильтруют, к фильтрату добавляют равный объему 8М водного рас- 5 твора NaCI, смесь выдерживают при 6ОC 12 ч, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 100 мл воды, диализуют против воды при 4 С 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 12 r порошка билирубиноксида- 10 эы (выход 1,2% от исходной массы сырья), к которому добавляют 10 мл глицина (0,2;(, от массы целевого продукта). При добавлении к образцу крови с высоким содержанием билирубина (более 20 ммоль/n) фермента в 15 концентрации 0,1 мг/мл происходит расщепление 95% билирубина, Билирубиндксидаза сохраняет активность при 4 С в течение 2-4 мес.

При изменении данной совокупности 20 признаков положительный эффект не достигается, что подается следующими сравнительными примерами.

Пример 4. 1 кг печени свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, 25 в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, и далее поступают, как в примере

1. Получают 9 г порошка, не обладающего способностью расщеплять билирубин в образцах крови даже в концентрации 0,1 30 мг/мл, Пример 5. 1 кг селезенки крупного рогатого скота измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина, и далее 35 поступают, как в примере 1. Получают 8 г порошка, при добавлении которого к образцу крови в концентрации 0,1 мл/мл не происходит расщепления билирубина.

Пример 6. 1 кг слизистой оболочки 40 тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,1 г эфедрина (0,01о от массы сырья), и далее поступают, как в примере 1. Получают 0,7 г 45 порошка билирубиноксидазы (выход 0,07о от массы исходного сырья), расщепляющей

55 билирубина в образцах крови при концентрации 0,15 мгlмл.

Пример 7, 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г фенилаланина (0,02 от массы сырья), и да- 55 лее поступают, как в примере 1. Получают 1

r порошка билирубиноксидазы (выход 0,1% от массы сырья), расщепляющей 65 билирубина в образцах крови при концентрации

0,2 мг/мл.

Пример 8, 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой не растворяют индуктор, и далее поступают, как в примере 1, Получают 1 г порошка билирубиноксидаэы (выход 0,1 % от массы сырья), расщепляющей 60 билирубина в образцах крови при концентрации 0,3 мг/мл.

Пример 9. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке, к фаршу добавляют 2 л воды, в которой предварительно растворяют 0,2 г эфедрина. смесь гомогенизируют 1 ч, затем фильтруют, фильтрат вливают в 3 л ацетона, охлажденного до 0 С (3 объема к массе сырья), перемешивают, выдерживают при

0 С 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 1 л воды, фильтруют, добавляют к фильтрату равный объем 6 М водного раствора NaCI u смесь выдерживают при 4 С ч, Вследствие наличия значительного количества липидов в осадке, который не подвергался дополнительному обезжириванию, как в примере 1, при высаливании осадок не образуется, что не позволяет выделить билирубиноксидазу.

Пример 10. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что фильтрат, получаемый после фильтрации гомогената, обрабатывают этиловым спиртом. Получают 0,5 г порошка билирубиноксидаэы (выход 0,05 oT исходной массы сырья), расщепляющей 35 билирубина в образцах крови при концентрации 0,15 мг/мл, Пример 11. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1,. за исключением того, что осадок после переосаждения из ацетона растворяют в воде и сушат сублимацией, минуя стадию диализа против воды. Получают 18 г порошка, не обладающего активностью билирубиноксидазы даже при концентрации 0,3 мгlмл в образцах крови.

Пример 12. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что к 8 r порошка билирубиноксидаэы (выход 0,8 от массы сырья) добавляют 4 мг глицина (0,05 от массы порошка), При этом фермент сохраняет активность при 4 С в течение 15 сут.

Пример 13. 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, эа исключением того, что к 8 г полученного порошка билирубиноксидазы (выход 0,8% от исходной массы сырья) не добавляют ста1693048

Составитель В.Соина

Редактор О,Юрковецкая Техред М,Моргентал

Корректор Т.Палий

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 билизатор. При этом фермент сохраняет активность при 4 С в течение 8 сут.

Пример 14, 1 кг слизистой оболочки тонкого кишечника свиней измельчают на волчке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что к 8 г полученного порошка билирубиноксидазы (выход 0,8 от исходной массы сырья) добавляют в качестве стабилизатора 8 мг глюкозы (0,1 (, от массы порошка). При этом фермент сохраняет свою активность при 4 С в течение 14 сут.

Предлагаемый способ получения билирубиноксидазы по сравнению с известным способом позволяет повысить выход фермента в 16-24 раза, увеличить количество расщепляемого билирубина в крови на 3045 при концентрации фермента, добавляемого в кровь, в 10 раэ меньшей, а также в

8,5 раз увеличить его стабильность при хранении в условиях низких температур.

Формула изобретения

1. Способ получения билирубиноксидазы, предусматривающий гомогенизацию кишечника млекопитающих в водной среде, 5 фильтрацию гомогената, высаливание с последующим растворением осадка в воде и сушку, отличающийся тем,что,сцелью увеличения выхода фермента, повышение его качества и стабильности, в качестве

10 сырья используют слизистую оболочку тонкого кишечника свиней, гомогенизацию проводят в присутствии эфедрина в количестве 0,02-0,04 от массы сырья, перед высаливанием проводят трехкратное

15 осаждение ацетоном, высаливание осуществляют 6-8 М водным раствором хлористого натрия при 4-6 С в течение 10-12 ч, а после растворения осадка проводят диализ против воды.

20 2. Способ по п,1, отл и ч а ю щи и с я тем, что после сушки целевой продукт смешивают с 0,1-0,2 глицина.