Способ выделения хондроитинсульфата из животных тканей

 

Изобретение относится к области производства медицинских препаратов, а именно получение биологически активного вещества - хондроитинсульфата. Сущность изобретения заключается в применении к процессу иного режима обезжиривания животного сырья - обработка водой при нагревании при 95-120^oC или 0,1-3,5 М водносолевым раствором при нагревании, а также добавлением в экстрагирующую смесь гидроокисей щелочных или щелочноземельных металлов. Данный способ обеспечивает более полное выделение хондроитинсульфата из животной ткани с повышением выхода в 1,7-2,3 раза.

Изобретение относится к области производства медицинских препаратов, а именно к получению биологически активного вещества хондроитинсульфата.

Хондроитинсульфат (ХС) относится к классу мукополисахаридов (глакозаминогликанов) полисахаридов животного происхождения. Структура ХС состоит из чередующихся остатков D-глюкороновой кислоты сульфатированного β--D-галактозамина [1] ХС широко применяется в составе лекарственных препаратов для лечения артологических и офтальмологических заболеваний, для заживления длительно не заживающих ран и т.п. Сырьем для получения ХС служат хрящи животных.

Известен способ получения ХС с применением протеолитических ферментов [2] Трахеи крупного рогатого скота или хрящи рыб измельчают, обезжиривают ферментативному гидролизу. Гидролизат отфильтровывают и осаждают ХС метанолом.

К недостаткам данного способа относится применение для обезжиривания и осаждения взрывоопасных и токсичных ацетона и метанола. Способ не обеспечивает необходимой чистоты продукта, в нем содержится значительное количество белков и пептидов.

Известен также способ выделения ХС путем экстракции водным раствором смеси хлористого калия и едкого калия, удаления их экстрактов балластных веществ действием уксусной кислоты уксусно-кислого калия и двухратного осаждения этанолам [3] Однако, такой способ не обеспечивает высокой степени чистоты ХС содержание белков и пептидов превышает 2% содержание ХС составляет около 75% [4] Наиболее близок к предлагаемому способу (прототип) выделения ХС путем обезжиривания трахей крупного рогатого скота нагреванием в воде при 60-95^oC, экстракции 0,5-3,5 М раствором хлорида натрия при 60-70^oС, сорбции на анионите АМ-п из 0,3-1,0 М раствора хлорида натрия при температуре 60-70^oС и рН 6,5-8,0 и элюировании 1,8-3,0 М раствором натрия [5] Данный способ обеспечивает выход ХС, не превышающий 12,1 г с 1 кг трахей.

Цель изобретения повышение выхода хондроитинсульфата.

Поставленная цель достигается тем, что обезжиривание проводят нагреванием в воде при 95-120^oC или в 0,1-3,5 М водносолевом растворе при 60-120^oC, экстракцию ХС 0,05-1,1 М водным раствором гидроокиси или водным раствором смеси гидроокиси (0,05-1,1 моль/л) и соли (0,1-3,5 моль/л).

Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом в обеспечении более полного выделения ХС из животной ткани. Это достигается с помощью более высокой степени обезжиривания. Обработка водой при 95-120^oC или 0,1-3,5 М водно-солевым раствором при 60-120^oC обеспечивает снижение содержание жира до 2-3% по сравнению с 6-8% остаточного жира при обработке по способу, указанному в прототипе. Более высокая степень очистки животной ткани от жира облегчает процессы экстракции и сорбции ХС. Добавление в экстрагирующую смесь гидроокиси обеспечивает полное извлечение ХС из животной ткани.

Пример 1. 1 кг трахей крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и переносят в колбу. Приливают 3 л 0,2 М раствора натрия хлористого. Нагревают смесь до 60^oC и перемешивают при этой температуре 8 ч. По окончании удаляют с поверхности жир. К смеси добавляют 60 г гидроокиси натрия, нагревают смесь до 30^oC и перемешивают при этой температуре 6 ч. Затем смесь нейтрализуют добавлением соляной кислоты до рН 5,0 и отделяют жмых. К экстракту добавляют 1,3 кг анионита марки АМ-п, нагревают до 50^oC и перемешивают при этой температуре 8 ч. Отделяют АМ-п от экстракта, отмывают водой, добавляют 6 л 1,5 М раствора натрия хлористого и перемешивают при комнатной температуре 5 ч. Отделяют раствор от анионита, фильтруют и осаждают 12 л этанола. Выделяют осадок и сушат при 50^oC. Выход ХС 27,0 г. Результаты анализа следующие: содержание ХС 98% [α]²_D⁰ 23^o, азот - 2,9% характеристическая вязкость [η] 0,23 дл/г.

Пример 2. Взвешивают 1 кг измельченных сухожилий свиней и переносят в колбу. Приливают 2,5 л 1,0 М раствора калия хлористого. Нагревают смесь до 100^oC и перемешивают при этой температуре 6 ч. Затем удаляют жир. К смеси добавляют 10 г гидроокиси калия, нагревают до 70^oC и перемешивают при этой температуре 8 ч. Затем смесь нейтрализуют добавлением соляной кислоты до рН 8,0 и отделяют жмых. К экстракту добавляют 1,5 кг анионита марки АВ 171 40/100, нагревают до 80^oC и перемешивают 6 ч. Отделяют анионит от экстракта, отмывают водой, добавляют 6 л 2,8 М раствора натрия хлористого и перемешивают при комнатной температуре 6 ч. Отделяют раствор от анионита. К раствору добавляют 10 мл 30%-го раствора перманганата натрия, нагревают до обесцвечивания раствора, добавляют 20 г активированного угля и перемешивают 2 ч. По окончании фильтруют раствор и осаждают 12 л этанола. Осадок выделяют и сушат при 60^oC. Выход ХС 21,0 г. Результаты анализа следующие: содержание ХС 97% [α]²_D⁰ -22^oC, азот 2,7% [η] 0,28 дл/г.

Пример 3. Взвешивают 1 кг измельченных хрящей быка и переносят их в автоклав. Приливают к ним 4,0 л воды, нагревают до 120^oС и выдерживают 4 ч. Затем удаляют жир. К смеси добавляют 160 к гидроокиси кальция, охлаждают до 10^oC и при периодическом перемешивании выдерживают в течение 48 ч. Затем смесь нейтрализуют добавлением уксусной кислоты до рН 7,5 и отделяют жмых. Экстракт обрабатывают 2,0 кг анионита Дауэкс 1 х 2 (фирмы "Sigma") при 30^oC. Отделяют анионит от экстракта, отмывают водой и обрабатывают 8 л 2,0 М раствора ацетата натрия. К раствору добавляют 100 мл перекиси водорода, нагревают до обесцвечивания раствора, добавляют 30 г каолина и перемешивают 2 ч. По окончании фильтруют раствор и осаждают 16 л ацетона.

Результаты анализа следующие: содержание ХС 99,0% [α]²_D⁰ - 20^oС, азот 2,5% [η] 0,22 дл/г.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает значительно более высокий выход ХС (21,0-27,0 г из 1 кг сырья) по сравнению с прототипом (12,1 г/кг) при сохранении высокой степени очистки ХС.

Литература 1. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). М. Высшая школа, 1978. 256 с.

2. Сакураи О. и др. Акцепт. заявка Японии, N 50-88291, опубл. 15.07.75 3. Касавина Б. С. и др. Авт. свид. СССР, N 157466, Бюл. изобр. N 18, 1963.

4. Зенкевич Г.Д. Лаб. дело, 1963, т.9, N 4, с.23-26.

5. Васюков С.Е. и др. Авт. свид. СССР N 153274, опубл. 22.08.89.

Формула изобретения

Способ выделения хондроитинсульфата из животных тканей путем экстракции хонороитинсульфата водным раствором смеси неорганической соли и щелочи, очистки экстракта от балластных веществ и осаждения целевого продукта спиртом, отличающийся тем, что, с целью снижения содержания в хондроитинсульфате примесей белковой природы и упрощения процесса, производят предварительное обезжиривание животной ткани нагреванием ее в воде или 0,1-3,5 M водном растворе неорганической соли при 60-120^oС, экстракцию хондроитинсульфата ведут при 40-70^oC, сорбируют хондроитинсульфат из экстракта на макропористом анионите при рН 6,0-8,0, 40-80^oC и концентрации неорганической соли 0,3-1,1 моль/л, элюируют хондроитинсульфат с анионита 1,4-3,0 М водным раствором неорганической соли и очищают хондроитинсульфат обработкой в водном растворе окислителем и активированным углем.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что неорганическая соль выбрана из группы, включающей хлориды, ацетаты, карбонаты или сульфаты щелочных или щелочно-земельных металлов.

3. Способ по пп.1-2, отличающийся тем, что окислитель выбран из группы, включающей перекись водорода, перманганат натрия или калия.