Способ диагностики бесплодия у женщин

 

Использование: в медицине, в частности в гинекологии. Сущность изобретения, диагностику бесплодия у женщин проводят на основании микроскопического анализа клеток эндометрия из аспирата полости матки или из отпечатка соскоба, которые окрашивают 2% раствором катионного красителя, в качестве которого выбирают бирюзовый прямой светопрочный, его связывание оценивают спектрофотометрически и при значениях оптической плотности 1 - 1,5 опт. ед. судят о нидации оплодотворенной яйцеклетки, а при значениях 2 - 2,5 опт. ед. диагностируют первичное бесплодие. Способ позволяет снизить травматичность при взятии проб, уменьшить трудоемкость, увеличить объективность прогноза лечения.

Изобретение относится к клинической медицине, может быть использовано в диагностике женского бесплодия.

Известно, что женское бесплодие обусловлено многими причинами: эндокринные факторы приводят к нарушению процесса овуляции, в результате чего возникает ановуляция, лютеиновая недостаточность, синдром лютеинизации неовулирующего фолликула; трубный фактор обусловлен анатомо-функциональным нарушением проходимости маточных труб. Причиной перитонеального бесплодия является спаечный процесс в малом тазу при проходимости одной или обеих маточных труб. Комплексное обследование женщины, страдающей бесплодием, многогранно и сложно, включает в себя гормональное исследование по тестам функциональной диагностики, определение гормонов и их метаболитов в крови и моче, функциональные пробы, эндоскопическое и ультразвуковое исследование.

Известен способ диагностики бесплодия, который является наиболее близким к прелагаемому изобретению по решению технической задачи, которая заключается в оценке функционального состояния слизистой матки. Он основан на гистологическом исследовании соскобов эндометрия, по которым судят о принципиальной возможности (или невозможности) нидации плодного яйца [1] При этом возможна оценка динамики изменения эндометрия бесплодных женщин до и после проведенного лечения. Общим с предлагаемым изобретением является применение микроскопического исследования клеток эндометрия.

Недостатками известного способа является высокая трудоемкость, и значительная длительность процедуры, которая включает в себя фиксацию препарата, заливку в парафин или другие среды, окраску полученных срезов и последующее микроскопическое исследование состояния стромы, желез, сосудов, свободных клеток стромы эндометрия. Сама биопсия по сути является инвазивным методом исследования, требующим достаточной инструментальной и методической оснащенности.

Целью предлагаемого изобретения является снижение травматичности при взятии проб и уменьшение трудоемкости, удешевление, ускорение диагностики бесплодия с одновременным увеличением объективности прогноза лечения.

В связи вышеизложенным вполне основано и целесообразно изыскание новых, более простых и не требующих больших материальных затрат методом определения способности женщин к значению, учитывая достаточно большой контингент больных, обследующихся по поводу бесплодия и необходимость постоянного мониторинга за динамикой изменения состояния эндометрия в процессе терапии бесплодия.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что клетки эндометрия из аспирата полости матки или из отпечатка соскоба окрашивается 2%-ным раствора катионного красителя в качестве которого выбирают бирюзовый прямой светопрочный, его связывание оценивают спектрофотометрических и при низких значениях оптической плотности (1 1,5 относительных единиц) судят о возможности нидации оплодотворенной яйцеклетки, а при высоких значениях оптической плотности (2 2,5 относительных единиц) диагностируют первичное бесплодие.

Оплодотворение и культивирование человеческой яйцеклетки в настоящее время применяется все чаще, однако доля наступления беременности, которая следует за трансплантацией эмбриона в матку, низка. Из многих факторов, которые могли бы влиять на успех данного метода функциональное состояние эндометрия оказывается самым значительным.

Для нормального осуществления репродуктивной функции, матка должна быть готова к обеспечению двух альтернативных процессов: 1) готовности к половому акту и оплодотворению яйцеклетки; 2) обеспечению развития оплодотворенной яйцеклетки, отрицающему возможность дополнительного оплодотворения. На уровне всего организма это выражается в циклическом характере репродуктивного процесса, регуляция которого обеспечивается половыми гормонами. На ультраструктурном уровне это выражается в циклическом изменении рельефа клеток эндометрия и других реакциях, запущенных соответствующим гормон-рецепторным комплексом.

Наряду с данными, полученными в экспериментальных условиях нами на клиническом материале проведен анализ рельефа клеточной поверхности при различных формах бесплодия женщин.

Принципиально важным оказалось сохранение микроворсинчатого рельефа апикальной поверхности эпителиоцитов при первичном бесплодии, которое характеризуется отсутствием имплантации яйцеклетки. Хорошо известно, что рельеф клеточной поверхности определяется состоянием цитоскелета, а изменения формы клеток во многом обеспечиваются соотношением и степенью полимеризации и распределением в клетке цитоскелетных белков.

Применяемый нами катионный краситель бирюзовый прямой светопрочный связывается с белками мембраны и примембранного комплекса. Он тестирует положительно заряженные аминные группы мембранных и примембранных белков, по-видимому, аргинина, лизина и протонированного имидозола. Окрашивая данным красителем препараты клеток, чья апикальная поверхность обильно снабжена микроворсинками и соответственно сильно развитым примембранным комплексом мы получили значительное связывание красителя с клетками. При окрашивании же препаратов с клетками, лишенными микроворсинок, мы отвечаем существенное снижение количества цетров сорбции и регистрируем слабое связывание с красителем.

Отпечатки с образца снимаются на заранее обезжиренные предметные стекла и, практически сразу начинается окрашивание. Время установления диффузионного равновесия, определенное с помощью методики цитофотометрии витально окрашенных образцов, описанной в работе Левина и Гольфанд при окрашивании в 2% -ном водном растворе бирюзового прямого составляет более 60 70 минут.

После окончания экспозиции препараты фиксируются в 70% спирте 10 минут и обезвоживаются в 96% спирте. Затем подсушенные стекла просматриваются под иммерсионным объективом (х100) и фото графируются. Определение содержания бирюзового прямого проводили на анализаторе изображения "Морфоквант" (Карл Цейс, ГДР) при монохроматическом света (длина волны 550 нм, диаметр зонда и шаг сканирования 0,4 мкм, объектив 50Х). Производили замеры оптической плотности окрашивания бирюзовым прямым, выраженную в относительных единицах.

Количественная оценка на анализаторе изображения "Морфоквант" показала существенные различия между этими группами больных в условных единицах оптической плотности на единицу площади измеряемой клетки. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью пакета программного обеспечения "Stratigrafic programm". Результаты статической обработки экспериментальных данных, доказывающие, что произведенные измерения поддаются нормальному распределению по критерию с уровнем значимости а=0,05 приведены в таблице.

Данные статистического анализа позволяют утверждать, различия достоверны, причем они заметны при визуальном просмотре препаратов.

Эффективность предлагаемого способа заключается в снижении трудоемкости и ускорении исследования исключаются сложные и дорогостоящие гистологические исследования, требующие фиксации биопсий, заливки в среды, приготовление срезов и последующее микроскопирование. Следует отметить, что применяемое в настоящее время гистологическое исследование дает только общее представление о морфологической структуре эндометрия и ее соответствии фазам менструального цикла. Предлагаемый нами способ окраски клеток эндометрия позволяет судить о состоянии клеточной поверхности, что дает объективную информацию о возможности нидации оплодотворенной яйцеклетки.

Снижается также и травматичность исследования, поскольку для получения необходимого количества клеток эндометрия достаточно одной капли аспирата из полости матки.

Кроме того, следует учитывать, что при лечении бесплодия наиболее важным является прогноз результатов лечебных мероприятий. Оценка перспектив нидации оплодотворенной яйцеклетки позволяет уменьшить количество безрезультативных операций по трансплантации эмбрионов. Это в свою очередь позволяет существенно снизить затраты на сложную и дорогостоящую клиническую работу и уменьшить степень воздействий на организм женщины. Важно отметить, что в комплексе клинических данных о состоянии репродуктивных органов женщин оценка состояния клеточной поверхности эпителия эндометрия несомненно имеет ведущее значение.

Формула изобретения

Способ диагностики бесплодия у женщин, включающий микроскопический анализ состояния клеток эндометрия, отличающийся тем, что клетки эндометрия из аспирата полости матки или из отпечатка соскоба окрашивают 2%-ным раствором катионного красителя, в качестве которого выбирают бирюзовый прямой светопрочный, оценивают его связывание спектрофотометрически и при значениях оптической плотности 1 1,5 опт.ед. диагностируют возможность нидации оплодотворенной яйцеклетки, а при значениях 2 2,5 опт.ед. диагностируют первичное бесплодие.

РИСУНКИ

Рисунок 1