Маркер для люминесцентного иммуноанализа

 

Использование: иммунодиагностика, в частности к химии реагентов для люминесцентного анализа. Сущность изобретения: реагент Pt-уропорфириноктакислота может быть использован в качестве маркера антигенов и антител при проведении люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением и позволяет уменьшить расход маркера при получении конъюгатов металлопорфинин/белок. Основные люминесцентные свойства: λ_{возб.макс.} = 381 нм; λ_{изл.макс.} = 646 нм; τ_затух. = 0,078 с; полуширина максимума возбуждения 20 нм; полуширина максимума фосфоресценции 21 нм; квантовый выход люминесценции 0,6-0,7.

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности, к химии реагентов для люминесцентного иммуноанализа и может быть использовано в качестве маркера антигенов и антител.

Одним из наиболее чувствительных методов люминесцентного иммуноанализа является метод, в котором используются ковалентно связанные с антителами или антигенами (иммунологическими компонентами) порфириновые соединения.

Известны маркеры для люминесцентного анализа для получения ковалентно меченых конъюгатов с иммунологическими компонентами, в качестве которых используют различные типы флуоресцирующих порфиринов: копропорфирины (Савицкий А. П. и др. ДАН СССР, 1197, т. 293, стр. 744-748), порфирины с заместителями по мезоположению (ЕР N0127797, кл. МКИ С07Д 487/22). Эти порфирины водорастворимы, имеют достаточно высокий квантовый выход флуоресценции (до 0,2), разнесенные по длинам волн более чем на 180 нм области возбуждения (380-420 нм) и излучения (600-640 нм) и флуоресценции, позволяют получить довольно высокую чувствительность иммуноанализа.

Однако при проведении твердофазного иммуноанализа чувствительность определения иммунологических комплексов с помощью этих меток ограничивается уровнем 10^-10.10^-11М и обусловлена тем, что эквивалентный уровень фонового сигнала дают примеси, рассеянный свет и собственно полистирольный планшет, в котором проводятся измерения.

Известно использование Pd-копропорфирина 1 в качестве маркера для проведения люминесцентного иммуноанализа (Савицкий А.П. и др. ДАН СССР, 1989, т. 304, стр. 1005-1008). Этот маркер по сравнению с безметальными порфиринами способен длительно люминесцировать-фосфоресцировать при комнатной температуре в водном растворе. Для этого соединения характерно: максимум возбуждения 392 нм; максимум люминесценции (фосфоресценции) 665 нм; коэффициент экстинкции в полосе возбуждения в водном растворе 188400; полуширина в полосах возбуждения 25 нм; время жизни фосфоресценции в водном растворе с сульфитом натрия Х-100 1,2·10^-3 с.

Существование длительной люминесценции Рd-копропорфирина со временем затухания 1,2·10^-3 с позволяет использовать его в иммунолюминесцентном анализе с временным разрешением (ИЛАВР) при чувствительности определения иммунологических компонентов до 10^-12М. Однако достигнутый предел детекции с помощью Рd-комплексов уступает хелатам с ионами Еu⁺³ типа β-дикетонов.

Наиболее близким аналогом предлагаемого маркера является Pt-копропорфирин-III-тетракислоты (а. с. СССР N1707539, класс МКИ G01N 33/532). Соединение имеет следующие характеристики: максимум возбуждения 381 нм; максимум люминесценции (фосфоресценции) 645 нм; полуширина в полосах возбуждения 20 нм; полуширина максимума люминесценции 21 нм; время затухания люминесценции в е раз в водном растворе с 2 мг/мл сульфита натрия и 0,1% тритона Х-100 при рН 7,4 0,75·10³ с.

Маркер получают реакцией тетраметилового эфира копропорфирина с солью двухвалентной платины в бензонитриле, а затем омылением платинового комплекса тетраметилового эфира действием 2N едкого кали в тетрагидрофуране до платинового комплекса тетракислоты копропорфирина.

Использование конъюгатов белка с Рt-копропорфирином обеспечивает высокий уровень люминесценции, однако при использовании в качестве маркера для проведения иммуноанализа обладает следующими техническими недостатками.

Рt-копропорфирин слабо растворим в водных растворах с рН 6,5. Поэтому для получения конъюгатов с белками по методике, описанной в ЕР N0027797, 1984 г. требуется введение органических растворителей таких, как диметилсульфоксид, диметилформамид и др. а также проведение реакции при неоптимальных условиях для карбодиимидного метода синтеза конъюгатов. Это приводит к избыточному расходу Рt-копропорфирина и антител, а также к необходимости очистки от агрегатов. Кроме того, достаточно высокая степень гидрофобности Рt-копропорфирина приводит к неспецифической адсорбции конъюгатов в процессе иммуноанализа и увеличению фонового уровня люминесценции, что в итоге снижает чувствительность, специфичность и надежность анализа при выявлении низких концентраций искомого биоагента.

Задачей изобретения является создание маркера для люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением на основе класса металлопорфиринов, который при использовании его в качестве люминесцентной метки для антигенов и антител позволит исключить указанные недостатки.

Поставленная задача решается синтезом по схеме 1 соединения Рt-уропорфирина кислоты.

Соединение (3) получают реакцией октаметилового эфира уропорфирина с солью двухвалентной платины в бензонитриле, а затем омылением комплекса октаметилового эфира действием 2 М едкого кали в тетрагидрофуране до платинового комплекса октакислоты уропорфирина.

Соединение (3) представляет собой после перекристаллизации из хлороформа с метанолом игольчатые кристаллы красновато-оранжевого цвета с температурой плавления > 300^oС.

Электронный спектр в хлороформе, λ_макс(ε·10^-3) нм: 381.2 (266.0); 502.5 (13,7); 536.7 (53.0).

Мас. спектр (РDMS), м. вес. вычисл. 1136,3; м. вес. найд. 1136.7. Элементный состав: вычислено, С 50,74; Н 4,61; N 4,93; найдено, С 50,44; Н 4,83; N 5,01. С₄₈H₅₂N₄O₁₆Pt.

Изобретение считается новым, так как по сравнению с прототипом позволяет получить новый технический эффект, заключающийся в том, что повышается уровень сигнала люминесценции при иммуноанализе за счет лучшей растворимости уропорфиринов в водных растворах и большей степени их мономеризации. Кроме того, более высокая степень растворимости уропорфиринов в нейтральных и слабокислых средах, в которых проводится реакция синтеза конъюгатов, позволяет увеличить выход готовой продукции (соотношение "порфирин-белок") на единицу белка при синтезе карбодиимидным методом. Большая растворимость уропорфирина по сравнению с копропорфирином достигается за счет увеличения числа корбоксильных групп в соединении (см. "Способ получения уропорфирина", положительное решение по заявке N 92-009671/13).

Техническое решение имеет изобретательский уровень, так как авторам из существующего уровня техники не известно соединение подобного вида, используемое в качестве маркера для иммуноанализа.

Пример 1. Платиновый комплекс октаметилового эфира уропорфирина 50 мг октаметилового эфира уропорфирина, приготовленного микробиологическим путем по методике, описанной в ЕР N0027797, 1984 г. растворяют в 40 мл бензонитрила, добавляют 50 мг хлорплатинида калия К₂PtCl₄ (D.Dolphin "The Porphurin in Academic Press", N4, 1978, v.1, р. 471) и кипятят 15 ч в токе азота до исчезновения полосы поглощения при 625 нм. Бензонитрил отгоняют в вакууме, платиновый комплекс очищают с помощью колоночной хроматографии на оксиде алюминия в хлороформе. Отбирают наиболее подвижную красновато-оранжевую зону. Растворитель упаривают, вещество перекристаллизовывают из хлороформа с метанолом, получая 36 мг (60%); т.пл. > 300^oС.

Электронный спектр в хлороформе, λ_макс(ε·10^-3) нм: 381.2 (266.0); 502.5 (13.7); 536.7 (53.0).

Мас. спектр (РDMS), м. вес вычисл. 1136,3; м. вес. найд. 1136,7. Вычислено, С 50,74; Н 4,61; N 4,93. Найдено, С 50,44; Н 4,83; N 5,01. С₄₈H₅₂N₄O₁₆Pt.

Пример 2. Платиновый комплекс уропорфирина. К раствору 16 мг октаметилового эфира уропорфирина в 5 мл тетрагидрофурана добавляют 5 мг 2N едкого кали и нагревают 2 ч. Тетрагидрофуран удаляют в вакууме, остаток разбавляют в 10 раз водой и металлокомплекс высаживают при рН 2,8. Осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат в эксикаторе над оксидом фосфора. Получают 13,8 мг (95%).

Электронный спектр в 1% растворе бикарбоната натрия, λ_макс(ε·10^-3) нм: 381 (191,0); 502.5 (9,5); 534.5 (28,0). Люминесцентные характеристики Рt-комплексов уропорфиринов октакислоты представлены ниже: максимум возбуждения 381 нм; максимум люминесценции (фосфоресценции) 646 нм; полуширина максимума возбуждения 20 нм; полуширина максимума фосфоресценции 21 нм; квантовый выход люминесценции 0,6-0,7; время τ затухания люминесценции в"е" раз 0,078·10^-3.

Условия регистрации: водный раствор с 2 мг/мл сульфита натрия и 0,1%-ный тритон Х-100, рН 7,4.

В таблице представлены данные сравнительной оценки люминесцентных свойств конъюгатов антител с Рt-копропорфирином тетракислоты и Pt-уропорфирином октакислоты.

Условия регистрации: l_возб. 381 нм, λ_{регистр.} 645 нм; нужная длина волны выделялась с помощью интерференционных фильтров; время задержки строба 50 мкс, длительность строба 100 мкс, время регистрации 1 с. Регистрация проводилась в полистироловых стрипах (ТУ-64-2-375-86). Анализ осуществлялся на приборе ИФИ-01 (производство ГосНИИ БП). Из данных таблицы видно, что предлагаемый реагент детектируется с пороговым уровнем детекции выше, чем Рt-копропорфирин тетракислота в среднем в 1,3 раза.

Пример 3. Получение конъюгатов Рt-уропорфирина октакислоты с иммуноглобулином человека класса IgG.

Для получения конъюгатов используют соотношение реакционных масс "белок-порфирин-карбодиимид", равное 1: 20:200 (см. ЕР N0027797, 1984 г.). Растворяют 0,5 мг Pt-уропорфирина октакислоты в 0,8 мл 0,01 М фосфатного буфера с 0,15 М хлористого натрия при рН 7,3. Растворяют 1 мг хлоргидрата 1-этил-3-диметиламинопропилкарбодиимида (фирма "Serva", ФРГ) в 0,2 мл 0,01 М фосфатного буфера. Доводят рН буфера с 7,3 до 6,0 добавлением 0,1N соляной кислоты, смешивают 0,2 мл раствора карбодиимида и 0,8 мл Рt-уропорфирина октакислоты и выдерживают смесь при рН 6,0 в течение 30 мин при 20^oС. К реакционной массе добавляют 0,2 мл раствора белка в концентрации 20 мг/мл (IgG человека производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея) в 0,01 М фосфатном буфере и доводят рН раствора до 7,5-8, используя 1N едкий натр. Смесь выдерживают 4 ч при комнатной температуре, затем добавляют 0,1 мл моноэтаноламина (фирма "Serva", ФРГ) и после инкубации в течение 15 мин проводят отделение конъюгатов белка от свободного Рt-уропорфирина октакислоты на колонке 1х28 см с сефадексом G-50 при элюировании 0,3 М трис-НСl буфером при рН 7,4 со скоростью 0,5 мл/мин.

Расчет содержания белка и порфирина в конъюгате осуществляют по формуле Соотношение белок/порфирин в конъюгате 1,36/0,44 3,08.

Использование аналогичных концентраций и соотношений реакционных масс для Рt-копропорфирина тетракислоты обеспечивает получение конъюгатов с соотношением копропорфирин/белок 1,6.

Таким образом, использование Рt-уропорфирина октакислоты позволяет увеличить выход конъюгатов с белком по сравнению с Рt-копропорфирином почти в 2 раза.

Использование Pt-упропорфирина октакислоты при получении конъюгатов антигенов или антител с металлопорфирином позволяет улучшить соотношение металлопорфирин/белок, что приводит к увеличению выхода целевого продукта. Кроме того, Рt-уропорфирин обладает лучшими люминесцентными свойствами. Все это приводит к упрощению и удешевлению проведения иммуноанализов.

Получение Рt-уропорфирина и конъюгатов антигенов или антител с ним осуществляется на стандартном оборудовании по известным методикам с использованием выпускаемых промышленностью реагентов.

Предлагаемый реагент найдет применение в иммуноанализе в качестве люминесцентного маркера антигенов и антител, которые входят составной частью в диагностические тест-системы для анализов, и может быть использован в медицине, ветеринарии, микробиологии и др.

Формула изобретения

Pt-Уропорфирин октаксилота формулы как маркер для люминесцентного иммуноанализа.

РИСУНКИ

Рисунок 1