Маркер для люминесцентного иммуноанализа

 

СОЮЗ COBETO- ИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4813086/13 (22) 10.04. 90 (46) 23.01. 92. Бюл. Н 3 (71) Все союзньп научно-исследовательский ин ститут биоло гиче ско го приборостроения и Московский институт тонкой химической технологии им. М.B Ломоносова (72) Н.С.Осин, В.Д.Румянцева, Е.ц. Прошин". и А.Ф.Миронов (53) 576. 8,078(038. 8) (56) ДАН СССР, 1987, т. 293, с. 744-748.

EP Р 0127797, кл. С 07 D 487/22, .С 09 В 47/00, G 01 N 33/54, 1983.

° ДАН СССР, 1989, т. 304, с. 1005- 100 8. (54) МАРКЕР ДЛЯ ЛНИИНВСЦЕНТНОГО ИМ—

МУНОАНАЛИЗА (57) Изобретение относится к иммуноИзобретение относится к иммунодиагностике, в частности к химии реагентов для люминесцентного иммуноаналиэа, которые могут быть использованы в ка— честве маркера антигенов и антител.

Одним иэ наиболее чувствительных методов люминесцентного имм;ноанализа .

l является метод с использованием ковалентно связанных с антителами или антигенами (иммунологические компоненты) пор .ириновых соединений.

В качестве маркеров для люминесцентногз ала;и:за длл ., ченшя ..овалентно меченых конъюгатов с ымунологическими компонентами используют различные типы флуоресцирующих порфиринов, например копропорфирины и пор(51)5 G 01 N 33/532 С 09 В 47/00 диагностике, в частности к химии реагентов для люминесцентного ппгуноаналиэа. Реагент может бьггь использован в качестве маркера антигенев и антител. Цель изобретения — повьппение чувствительности люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением с использованием маркерол класса металлопорфиринов, а также синтез соединения, которое обладало бы лучними люминесцентн;/ми свойствами по сравнению

c . звестными маркерами. Поставленная за/,ача рсшаетсл синтезом соединения

Pt--xorrpo o irpnva ТТТ тетракислоты.

Данное соединение примерно в 5 раз превосходит по уровню люминесценции а

Ю

Pd-копропорфирин I и обеспечивает босов высокую чувствитслвкость люылкес- Я центной детекции меченых соеди енийч

2 .табл. фирины с заместителями IIo мезоположению

Эти порфирины водорастлоримы, имеют достаточно высокий квантовый выход флуоресценции (до О,?), разнесенные по длинам волн (более чем на 180 нм) области возбуждения (380420 нм) и излучения (600-640 нм).

Кроме того, полосы возбуждения и излучения порфиринов имеют полуширину до 20-25 нм, что позволяет, по сравнен;по с друпп:и Флуоресп нт л:п1и метчиками, достигнуть болье ей чу;.ствительности иммуноанализа эа счет указанных вьппе спектрально †ломинесцентных характеристик и высокого коэффи1 3 1707539 циента экстинкции (6=150.000-200.000) в полосе Соре (380-420 нм).

Безметальные порфирины имеют время . л

i затухания лкиинесценции в водных растворах при комнатной температуре порядка 1-10 10 с.

В твердофазном иммуноанализе чувствительность определения иммунологических компонентов с помощью этих меток 10 ограничивается уровнем 10 -1О Н и обусловлена тем, что эквивалентный уровень фонового сигнала дают примеси, рассеяный свет и собственно полисти1Рольный планшет, в котоРом проводятся.15, эти измерения.

Наиболее близким аналогом предлагаемого маркера для люминесцентного — . . иммуноанализа является Pd-копропорфирин, Этот реагент, по сравнению с без-20 метальными порфиринамк, способен длительно люминесцировать-фосфоресциро вать при комнатной температуре в водном растворе.

Для этого соединения характерно: 25 максимум возбуждения — 392 нм, максимум люминесценции (фосфоресценции)—

665 нм, в полосе возбуждения в водном растворе 6188 400, полуширнна в поло": сах возбуждения и фосфоресценции

25 нм, время жизни фосфоресценции в водном растворе с сульфитом натрия (2 мг/мл) и 0,1Х тритона Х-100 1,2к

С10 с.

I для Pd-копропорфйрнна время задержки между актом возбуждения люминесценции и началом регистрации фосфоресценции составляет 0,2 10 (время, эквивалент- кое времени затухания фосфоресценции), 1 т

lIo сравнению с другими описанными в литературе металлопорфиринами, такими как 2п-, А1-, Sn-, Pd-комплексы, предлагаемый более чем в 10 раз превосходит их по уровню интенсивности люминесценции.

Тем не менее, достигнутый предел детекцни с помощью Pd-комплексов уступает хелатам с ионами Еи типа -дикетонов.

Целью изобретения является повышение чувст вительности люминесцентно го иммуноанализа с временным разрешением с использованием маркеров класса ме-. таллопорфирлнов, а также синтезсоед& нения которое обладало бы лучшими люминесцентными свойствами по сравнению с известными маркерами.

\ со ос, (H

СООСН., СН, Cln

СИ2 к (ис1) CGHbCN

Сн

Конъюгаты с иммунологическнми компонентами для Pd-комплексов порфиринов получают путем их.актнвалии с использованием карбодинмндов н последующего связывания с аминогруппами иммунологи-40 ческих компонентов.

Существование длительной люминесценции Pd-копропорфирина со временем затухания 1,2 ° 10 с позволяет использовать его в иммуиолюминесцентном анализе с временным разрешением (HJIABP) и повысить чувствительность определеяия иммунологических компонентов до

10 «Х. 50

Поставленная задача решается синтезом по схеме соединения Pt-копропорфирина III тетракислоты.

СН

Повышение чувствительности в ИЛАВР постигается за счет резкого снижения фона примесей и исключения влияния рассеянного света. Технически это обеспечивается тем, что процесс регистрации люминесценции ведут раздельно во времени от акта воэбужрения.

СН

СН

6юсн, 1

1707539

ÑÎÎÑÅ4

I сн, ( сн

СООН

I сн

Сн

СООСЦ сн сн H

КОН,„ cooн

С сн, мееЗ р

ТГф

СН3 НС

СН, Н

2 соосн, СН

СН, I

Сн

СН, 1

СООН

СН2 сн

COOH

Соединение (3) по тучаит реакцией

30 тетраиетилово ro эфира копропорфирина с солью двухвалентной платины в бензонитриле, а затем омылением платинового комплекса тетраметилового эфира действием 2И едкого кали в тетрагидрофуране до платинового комплекса тетра35 кислоты копр>порф»»рина.

Соединение (3) представляет собой игольчатые кристаллы (из хлороформа и метанола) оранжевого цвета, т.пл.

191-19:. С, и характеризуется следуюцими спектральн».ми данными.

ИК-спектр (СНС1 ), Р, сг» : 1720,7 (COg -CH 3) .

Электронный спектР, (СНС1 ), 45

ax!0 З нм: 381,3 (285); 501,5 (12,8);

561, 1 (50) .

Элементный состав.

Найдено, 7.: С 53,14; Н 4,93;

N 6,19.

С »оИо !И408Е>с

П р и и е р 1. !!лат»»новьп» комплекс тетраметилового э»Ь»»ра копропорфирина III.

240 мг по»>,>»»Р:ша (Е) растворяют в

$O мл бензон»: !>и»а. >б>а»»;»ян- 1о мг

55 (1, 1 моль) хлороплатинита калия (k(PtC! )) и кипятят с обратным холодпльннкои. Контроль за протеканием реакции ведется спектрофотометрическг,.

Через 8 ч добавляют е»»е 80 мг (055 моль) соли и продол>»ают нагревание до тех пор, пока и спектре нс исчезнут полосы, характерные для свободного основания пор»>»»рш»а. При том отнов»ег»»»е полос о Р составляет 3-3,."., Бензонитрил отгоняют при пониженном давлении. 0стато»: растворяют в хлороформе и хроиатографируют »»а си»в»кагеле 40/100 р в системе хлороформ-мета- . нол (?: 1) . Отбирают фрак»»»»ю ора»»жево го цвета, содержащую платиновья» комплекс (ЕЕ) . Допол»штель»»ую очистку (проводят с поиог(ью препаративной тонкослойной хроиатографии на окиси алюминия Е1г степени активности в хлороЛорие. Отделя»от наиболее подв»»>ю»ую зону платинового комплекса, вецество

; элюируют с окиси алюга»г»»»я смесью хлорсАорм-эЬир (5:2). Раствор»»тели упа, ривают досуха. Ппат»»нов»,»>» ког»плекс перекристаллизовк»вают иэ смеси хлороформ-метанол, получая 174 иг (577.), т.пл. 191 †? С.

Эпектронный спект" (СНС111, A,л »»i»

1»>»it» ° 381 3 (-8>) > i °" ° >8i у

$36, 1 (50) .

ИК-спектр, (СНСЕ ), Ь, сг» . 1720 (co0cH>).

П!Р-спектр (CDC1-), б:

9,67 (с, Н); 9 65 (с, Н);

1707539 8

9,68 (с, Н); ти 650-800 ни, соот»»ог»ение уровня сан

9,63 (с. Н, . дартного сигнала для» —.-600; 700

° ф

-иезо-Н); 4, 18 (8Н, т, СН СН, СООСН );

3,66 (6Н, с, CHy) e 3,64 (6lI. с, СН!);

3,45 (6Н, с, СН!); 3,4! (6Н, с, СН ) д

3,17 (8Н, -т CHgCO0»сH g) .

l1acc-спектр, г»/е, „: 905 (1Р, 75);

904 (21®, 100); 906 (И, 65) 832 (69); 831 (73); 830 (58), 759 (8);Ð 758 (15); 0

757 (7); 686 (11); 685 (21); 684 (19);

613 (13); 612 (13); 611 (19), t»* 635,5 (904-» 758) .

Найдено, 7: С 53,52; Н 5,04;

С40 ПО»-» 08 С

Вычислено, Х: С 53,14; Н 4,93;

И 6,19.

П р и и е р ?. Платиновый комплекс тетракислоты копропорфирина 711 (III) .20

170 иг платинового комплекса тетраметилового эфира копропорфирина III (II) суспендируют в 15 ил тетрагидрофурана добавляют 15 ил .". И едкого кав

»5 лия и кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч. Тетрагидрофуран упаринают и вакууме, оставшийся раствор разбавляют в 10 раз водой, фильтруют, подкисляют 107.-но» соляной кислотой до рЛ 4,0. Выпавший темно-крас- 30 ный осадок (III) отфильтровывают, промывают водой и су»эат в эксикаторе .над пят»»ок»»сью фосфора. Все 155 иг (98X). .Злектроннь»й спектр (NaHCO1),A »rr»» .,35

365,5, 504,7, 536,3, a,ф= .,38.

Лю>п»»»есцентнне характеристики

Pt-комплексов копропорфиринов I, III тетракислот» l предстанлены ниже: максимум возбужден»»я 38! нм (F.!О =284);40

- 3 иаксимуи люминесценции (фос»»оресцен»(ии) 6М ни, полумир»»на максимума воэбу щення 20 ни, пол л»ирина максимума фосфоресценции 21 ни, квантовый выход люминесценции 0,6-0,7. Время зату- 45 хания лю»н»несценции (н е раз) 0,075 "

>1О с.

Условия регистрации: вОд»»ый» раствор с ?»»гlмл сульфита и 0,1Е-ны»» тритон Х-100, рН 7,4. 50

В табл. предстанлень» да»»нь»е сравнительной сценки люи»»»»есцент»»ых

c»»or!cxr» ко»»ъюгато»» антител с раэлич»»-»»»»еткаии (!0 1!) . Л»»ал»»з проведен сп«» трофлуор»»»»етре е r»pe>»er»»h» » раз-;5 «»зеннем модели»,S-5В *»»р»»ь» Рerkinъ

"rr«беэ»»opper»r»r»»r на чувствитель"ОСть По длинаи г;Ол»». »»Увств»»тельность

° луор»»»»етра эаиетно снижается в обласи 800 ни соотнетстненно: 1; 0,4 и 01 отн. ед.

Иэ данных табл. 1 видно, что конъюгат»» белка с предлагаемым реагентом почти в 5 раз превосходят по уровню лю»н»несце»»ц»»»» конъюгаты с Pd-копропорфиринои и близки к уровню люиинесценщ»»» ионов F» в усил»»наюше»» растворе + ф»»ри»л».КВ Ila11ac.

В табл. ? предстанлен»» сравнительные данные по чувствительности метода

ИЛЛЗР с предлагаемыми метками на отечестненнои h yopr»»»elope с нреиенныи разрешением (ВНИИ БП).

Условия рег»»стра»»»»и для Pd-копропорфирина r» F u оптиии зированы, а

3»для Pt— - кОпрОпоphr»p»»на такОй Оптими зации не проведено из- за конструктивных особенностей прибора — ограничение нреиени задержки строба уровнем

0,125 10 с и нреиени регистрации

0,5 ° 10 с.,»»ля Pt-копропорфирина опти»»аль»»».»»»»» являются условия td (t за —, держки) =41,05 10 с, tr, (t регистраци»») =О, 2 10 ñ.

Из данных табл. ? видно, что пред.— лагае»а.»»"» реагент детектируется на уровне реагента фирмы !.КВ !!а11ас с чувств»»тель»»ость»» не менее 10 !1.

Кроме того, у»»»т».»ная в»»сокий коэффициент светиност»» (произведение кванто»»ого выхода на Й(ЕС1) н полосе лов глогiения) предлагае»»ого реагента í". уровне (.84 10 х0,6)=170,400, который превосходит»»oath»»ry»errx свет»»мости для ионов Fu + — соответственно (30,000x0,7)=2 1,000 и Pd êîïðîпорфирина (!84,000x0,2) =36,000.

Такии образом, Pt — копропорфириц

111 тетрак»»слота обладает лучшими

»»юминесцент»»ы»»и свойства»»»» как маркер для л»»»»»»»»есцентного анализа.

По сравнению с маркерами на Осно !+ ве ионов Fu предлагаем»»»» нами реагент позволяет упростить иииуноанализ эа счет исключения стадии, связанной с переводом ионов Fu н люиинес + цируюций коиплекс, так наэываемьг» усилинаюз»»й раствор.

Геаг:»т »ай»лет пр»»»»е»»е»»»»е в и;»иу»»оана»»»»зе r» качестве лп»»»»с. цен ного иаркера антигенов и антител, которые входят составной частью в диагностические тест-с»»сте»»»» для»»ю»унных аналиэон.

1707539 как маркер для люиинесцснтного иммуноанализа.

Формула изобретения

Pt-копропорфирин III тетракислата формулы СООН ( си

СН

C0Oll

СН

СН

СН

CHý

СН, СН

-СН, С11, 1 I

СООН СООН .Та-бли ца 1

Еи в усиЭ4ливающем расткоре (LKB Ыа11ас) Параметр

Рс-копропорфи- Pt-rcorrponophvрйн I рин III

Интенсив-, ность, отн. ед.

Иаксималь1120

230

1 200 ное возбуждениее, чм

Иак сима ль340

392

381 ное излучение, нм

Время затухания (х10 ), с

615

665

645

0,075

0,7

192

Та блица 2

Интенсивность люминесценции, тыс. имп. с, на приборе ВНИИ БП

Кон цен т рация Pt-копропорЬирип II метки в пробе, 11 М=0,125 10 с

tg=O,5 10 с

Рс-копропорфирин Т

td=O 25 10 с

10 Зс

*Перегрузка показаний прибора при количестве импульсов (> 400,ЮО), превышающем разрепение прибора, на цифровом индикаторе показания ограничиваются 100,000-2SO,OOO (в скобках указано отношение уровня сигнала к фону).

10 M

10 10 "

10-" . Фон раствора

200*

104*, 27,0 (9)

5,8 (1,9)

3,0

49,0 (70)

6,8 (9,3)

1,5 (Д,1)

0,9 (1,3)

0,7 3+

Еи в усиливающем растворе сс10,25 . 10 с

Сд10 с

200*

80 (80)

9,0 (9)

1,9 (1,9)

1,0