Стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов и способ его использования

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов. Согласно изобретению стимулятором эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов является глутатион окисленный, представляющий собой димер глутатиона восстановленного, со структурой гамма-глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками. Согласно изобретению фармакологическое средство, предлагаемое для лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, содержит в качестве действующего вещества эффективное количество глутатиона окисленного. При этом целесообразно, чтобы лекарственная форма данного фармакологического средства представляла инъекционный раствор глутатиона окисленного, в фармацевтически приемлемом растворителе в концентрации 0,01 - 2,0 %. Согласно изобретению для усиления и продления лечебного эффекта фармакологического средства целесообразно, чтобы инъекционный раствор дополнительно содержал фармацевтически приемлемый компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, например перекись водорода в концентрации 0,003 %. Согласно изобретению способ лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, включает парентеральное введение фармакологического средства в виде инъекционной лекарственной формы в дозах 0,01 - 0,5 мг на кг массы тела, от одной и более инъекций в день, курсами длительностью один и более дней или непрерывно до момента достижения лечебного эффекта. 2 с. и 5 з. п. ф-лы, 21 табл., 4 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии и терапии, и может быть использовано для профилактики и лечения онкологических, инфекционных и других заболеваний, при которых стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов целесообразна по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Известно, что ряд гуморальных факторов, эндогенно вырабатываемых в организме млекопитающих, цитокинов и гемопоэтических факторов обладают высокой биологической активностью и способны оказывать существенный лечебный эффект при разнообразных заболеваниях у человека. Известно также о лечебном применении цитокинов и гемопоэтических факторов в экспериментальной и клинической медицине. Так в онкологической практике широко изучается применение интерлейкина 2 (IL-2), фактора некроза опухолей а (TNFa), гемопоэтических факторов (эритропоэтина, макрофагально-гранулоцитарного и гранулоцитарного колониестимулирующих факторов, GM-CSF и G-CSF). Не менее интенсивно применяют цитокины и гемопоэтические факторы в экспериментальной и клинической практике инфекционных заболеваний, например интерфероны (IFNg и IFNa), колоние-стимулирующие факторы и др. Колоние-стимулирующие факторы и эритропоэтин активно применяются в гематологии.

Следует отметить, что лечебное применение этих веществ, вводимых экзогенно, имеет ограничения, связанные с отсутствием приемлемых лекарственных форм или их высокой стоимостью, коротким сроком жизни веществ данного класса в биологических средах, трудностями в подборе доз, а также разнообразными токсическими и аллергическими эффектами.

В этой связи, с точки зрения достижения более стабильного и значимого лечебного эффекта, не сопровождающегося побочными явлениями, более предпочтительной является стимуляция эндогенной продукции аутологичных цитокинов и гемопоэтических факторов непосредственно в организме пациента. Лечебный эффект, достигаемый при подобной стимуляции естественного для организма процесса, лишен всех недостатков, связанных с экзогенным введением цитокинов и гемопоэтических факторов.

Известен ряд соединений, стимулирующих эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов в экспериментальных и клинических условиях, в том числе известно о применении микробных продуктов для лечения рака, что связано со стимуляцией эндогенной продукции фактора некроза опухолей. Продукты, способные взывать одновременную продукцию различных цитокинов и гемопоэтических факторов, получили название мульти-цитокиновых индукторов (Multi-cytokine inducer). К средствам подобного действия относят препарат убитых стрептококков, нокардий (Nocardia opaca) и другие бактериальные продукты.

Однако практически все вещества, обладающие подобной способностью, это или убитые микроорганизмы, или микробные продукты, или соединения с неустановленной или переменной структурой, что существенно ограничивает возможности их медицинского применения в лечебных целях, а в ряде случаев делает такое применение невозможным. Таким образом, до настоящего времени не известен приемлемый с точки зрения современной медицины и фармакологии стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.

В поисках медицински и фармакологически приемлемого стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов были проведены исследования, в ходе которых было обнаружено новое свойство известного ранее вещества окисленного глутатиона (глутатион окисленный, глутатион дисульфид, GSSG; далее GSSG), вводимого парентерально или действующего на изолированные клетки, стимулировать продукцию ряда цитокинов и гемопоэтических факторов и у млекопитающих (экспериментальных животных и людей) как в нормальных, так и в патологических условиях.

Окисленный глутатион (глутатион окисленный, глутатион дисульфид, GSSG; далее GSSG) известен как димер трипептида глутатиона, γ-глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками. Таким образом, как трипептид глутатион (глутатион, глутатион восстановленный, GSH; далее GSH), так и его димер - GSSG являются природными метаболитами и присутствуют в тканях и биологических жидкостях людей и животных. При этом, как в норме, так и в патологических условиях естественный уровень GSSG в крови и тканях организма недостаточен для стимуляции эндогенной продукции цитокинов.

Известны свойства GSH, как одного из важнейших участников метаболизма аминокислот и фактора обеспечения внутриклеточного гомеостаза. При этом большое значение имеют восстановительные свойства GSH и его функция донора восстановительных эквивалентов, которую молекула GSH способна выполнять благодаря наличию сульфгидрильной группы цистеинового остатка. Этим качеством GSH определяется и его роль как принципиального элемента одной из важнейших внутриклеточных антиоксидантных систем, включающей собственно GSH и два фермента его обратимого превращения в GSSG: глутатион пероксидазу и глутатион редуктазу. Постоянное функционирование данной системы необходимо для инактивации или восстановления как эндогенно образующихся оксидантов, так и активных метаболитов веществ, попадающих в организм извне.

Известно также участие GSH в обеспечении реакций детоксикации, протекающих с участием группы ферментов, объединяемых названием глутатион S-трансферазы. Данные ферменты способны коньюгировать молекулу GSH с самыми разнообразными ксенобиотиками, формируя связь между ними и глутатионом через тиоловую группу цистеинового остатка трипептида. Последующая деградация коньюгата осуществляется ферментами гамма-глутамильного цикла и может иметь значительные вариации, зависящие от природы ксенобиотика.

В естественных условиях накопления GSSG в количествах, достаточных для стимуляции продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, не происходит в силу постоянного восстановления GSSG в GSH. Восстановление GSSG в GSH, активно протекающее в кишечнике и печени, происходит также при введении GSSG через пищеварительный тракт, где кроме того GSSG как всякий продукт, состоящий из аминокислот, подвергается протеолитической деградации.

Известно о применении GSSG в качестве одного из компонентов пищевой добавки для усиленного питания больных. Однако при пероральном применении основная масса GSSG как вещества, имеющего пептидную природу, деградирует в пищеварительном тракте, а оставшаяся часть восстанавливается в клетках кишечника и печени до GSH и не поступает в общую циркуляцию. Таким образом, поступление GSSG в организм через пищеварительный тракт исключает возможность проявления его активности в качестве стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.

Известно, что повышение эндогенного уровня GSH в лечебных целях предлагается для стимуляции иммунитета, при лечении интоксикаций, отравлений, диабета, сердечно-сосудистых, инфекционных, а также других заболеваний.

Известно также использование экзогенного GSH или его прямых (g-глутамил-цистеин, n-ацетил-цистеин, n-ацетил-цистеинилглицин) или непрямых (2-оксотиазолидин-4-карбоксилат) биохимических предшественников, а также их солей и эфиров в качестве лекарственных средств или пищевых добавок при лечении различных заболеваний. Путем применения подобных веществ и их композиций предлагается повышать эндогенный уровень GSH для лечения различных заболеваний и интоксикаций.

Известно также о применении GSH как хемопротекторного агента в целях профилактики нейротоксичности при химиотерапии рака, а также о комбинации GSH с противоопухолевыми препаратами для повышения эффективности их действия.

В то же время, по данным общедоступных источников информации, в настоящее время неизвестно о применении GSSG как самостоятельного фармацевтического средства (в виде моновещества), в качестве стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, а также о его лечебных эффектах при заболеваниях человека и животных или о применении GSSG в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний.

В основу изобретения положена задача создания фармакологического средства, содержащего такое действующее вещество, которое обеспечивает стимуляцию эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов у субъекта, нуждающегося в этом.

"Субъект, нуждающийся в этом" означает млекопитающее, например человек, домашние животные и скот, имеющие одно или более проявление заболеваний, при которых стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов целесообразна с позиций современных биомедицинских знаний.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве действующего вещества, обеспечивающего стимуляцию эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов у субъекта, нуждающегося в этом, предлагается использовать GSSG, который при парентеральном введении стимулирует продукцию ряда цитокинов и гемопоэтических факторов у млекопитающих (экспериментальных животных и людей) как в нормальных, так и в патологических условиях.

Согласно изобретению стимулятором эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов является глутатион окисленный (GSSG), представляющий собой димер глутатиона восстановленного, со структурой g-глутамил-цистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками.

Было впервые установлено, что прямое воздействие экзогенного GSSG на клетки млекопитающих (человека или экспериментальных животных), способных продуцировать цитокины или гемопоэтические факторы, оказывает стимулирующее действие на синтез последних и их высвобождение в кровь или окружающую среду, что приводит к повышению их концентрации в сыворотке крови (в условиях in vivo) или культуральной жидкости (в условиях in vitro и/или ex vivo). Изобретение позволяет достичь эффекта, заключающегося в стимуляции продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, получаемого при введении GSSG в организм или культуральную среду, в том числе при введении GSSG в составе фармацевтически активных композиций, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в окисленной форме. Результаты выполненных исследований также показали, что благодаря данному свойству GSSG и фармацевтические композиции с его участием обладают лечебным эффектом в различных патологических ситуациях в эксперименте и клинике.

Видимо обнаруженная стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, вызываемая GSSG, является первичной по отношению к противоопухолевому, противоинфекционному, гемопоэтическому и иммуностимулирующему, а также другим фармакологическим эффектам, обеспечивающим в свою очередь достижение той или иной степени лечебного или профилактического действия при различных заболеваниях.

Согласно изобретению лечебное средство, предлагаемое для лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, содержит в качестве действующего вещества эффективное количество GSSG, при этом целесообразно, чтобы лекарственная форма данного фармакологического средства представляла инъекционный раствор, содержащий GSSG в концентрации 0,01 2,0 Согласно изобретению, предлагается использование таких лекарственных форм GSSG и/или фармацевтических композиций с его участием, которые бы способствовали продлению пребывания глутатиона в биологических жидкостях и тканях в окисленном состоянии или могли бы усилить обнаруженные биологические и лечебные свойства GSSG.

Согласно изобретению для усиления и продления лечебного эффекта GSSG как лечебного средства целесообразно, чтобы лекарственная форма данного средства (инъекционный раствор) дополнительно содержала фармацевтически приемлемый компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме.

В качестве фармацевтически приемлемого компонента, способного продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, предлагается использовать, например, перекись водорода в концентрации 0,003 Это связано с тем, что в присутствии перекиси водорода (H₂O₂), являющейся донором активных форм кислорода (то есть окислителем), восстановление GSSG до GSH, осуществляемое глутатионредуктазой, протекает с меньшей скоростью, благодаря чему создаются условия для более медленного восстановления вводимого в биологические среды экзогенного GSSG.

При этом использование в составе лекарственной формы перекиси водорода (H₂O₂) в концентрации, фармацевтически приемлемой для парентерального введения, а также любых других прооксидантно-активных соединений (доноров активных форм кислорода) позволяет реализовать лишь одно из возможных технических решений, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в биологических жидкостях и тканях в окисленной форме с достижением результата, заключающегося в усилении и продлении фармацевтических эффектов GSSG.

Были установлены также другие фармацевтически приемлемые компоненты, способствующие более медленному протеканию процесса восстановления экзогенного GSSG в GSH в биологических средах. Таковыми, в частности, являются факторы, способные вступать в конкурентные отношения с восстановленной формой кофермента никотинамидадениндинуклетидфосфата или НАДФ·Н (инозин и другие производные гипоксантина), а также вещества, обратимо тормозящие процессы восстановления окисленной формы НАДФ⁺ в НАДФ·Н, например такие ингибиторы глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы как цистамин (2,2'-диаминодиэтилдисульфид).

Поскольку восстановленный никотинамидадениндинуклетидфосфат (НАДФ·Н) является ключевым кофактором ферментативной системы глутатионредуктазы, катализирующей реакцию восстановления GSSG в GSH, любые другие фармацевтически приемлемые химические соединения или биофизические воздействия, снижающие эффективность его восстановления или блокирующие его биологическое окисление глутатион редуктазой, также могут способствовать продлению пребывания GSSG в биологических средах в окисленном состоянии, а следовательно, могут усиливать или продлевать лечебный эффект GSSG.

В результате проведенных исследований было впервые обнаружено, что фармацевтический и лечебный эффект GSSG усиливается при его использовании в комбинации с веществами, вступающими в конкурентные отношения с НАДФ·Н, а также с веществами, обратимо ингибирующими ферментативную реакцию, катализируемую глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой, в результате которой происходит восстановление окисленной формы НАДФ⁺.

Таким образом, помимо перекиси водорода, другим фармацевтически приемлемым компонентом, способным продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, является гипоксантинрибозид (инозин, или 9-b-рибофуранозилгипоксантин), который предлагается использовать в качестве 0,1 раствора.

Выполненные исследования показали, что гипоксантинрибозид оказывает потенцирующее действие в отношении фармакологических и лечебных эффектов GSSG. Было установлено, что данное свойство гипоксантинрибозида проявляется вследствие его способности вступать в конкурентные отношения с НАДФ·Н, чем достигается замедление реакции восстановления GSSG в GSH. Более того, было установлено, что данным свойством обладают и другие производные гипоксантина, в том числе нуклеозидные производные инозина.

Также, помимо упомянутых выше перекиси водорода и гипоксантинрибозида, другим фармацевтически приемлемым компонентом, способным продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, является цистамин (2,2'-диаминодиэтилдисульфид), который предлагается использовать также в качестве 0,1 раствора.

Выполненные исследования показали, что цистамин, оказывает потенцирующее действие в отношении биологических и лечебных эффектов GSSG. Было установлено, что данное свойство цистамина проявляется вследствие его способности осуществлять обратимое ингибирование пускового фермента пентозного цикла, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, катализирующей реакцию восстановления НАДФ⁺ в НАДФ·Н.

Таким образом, изобретением также предлагается способ потенцирования способности окисленного глутатиона (GSSG) стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, заключающийся в том, что GSSG используют в составе фармацевтических композиций, содержащих компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме. Это достигается путем использования фармацевтически приемлемых композиций, содержащих лекарственные формы GSSG и лекарственные формы веществ, способных продлить пребывание глутатиона в биологических средах в окисленной форме, например 0,002 раствор перекиси водорода (иди другие прооксидантно активные соединения), 0,1 раствор гипоксантинрибозида (или другие производные гипоксантина, в том числе нуклеозидные производные инозина), а также 0,1 раствор цистамина (или другие соединения, способные осуществлять обратимое ингибирование пускового фермента пентозного цикла, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).

Установлено, что парентерально (внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное и т. д.) применение GSSG в 1 5 мл 0,003 раствора перекиси водорода, GSSG в 1 5 мл 0,1 раствора гипоксантинрибозида, а также GSSG в 1 5 мл 0,1 раствора цистамина стимулирует эндогенную продукцию TNF-альфа, IFN-альфа и IFN-гамма, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, эритропоэтина и GM-CSF у экспериментальных животных в большей степени, чем это наблюдается в случае применения только GSSG.

Проведенные исследования подтверждают способность вышеупомянутых соединений (перекиси водорода, гипоксантинрибозида и цистамина) усиливать биологические и лечебные эффекты GSSG и свидетельствуют о целесообразности их сочетанного применения с GSSG в целях повышения эффективности лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов целесообразна по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Таким образом, согласно изобретению с целью усиления и продления лечебного эффекта GSSG целесообразно, чтобы лекарственная форма данного соединения (1 5 мл инъекционного раствора) содержала дополнительные фармацевтически приемлемые компоненты, способные продлить пребывание экзогенного GSSG, введенного в биологические среды организма, в окисленной форме, например: а) перекись водорода в концентрации 0,003 или любые другие фармацевтически приемлемые прооксидантно-активные соединения, являющиеся донорами активных форм кислорода; б) гипоксантинрибозид (инозин, 9-b-рибофуранозилгипоксантин) в концентрации 0,1 или любые другие фармацевтически приемлемые метаболические конкуренты НАДФ·Н, способные тормозить восстановление GSSG в GSH, катализируемое глутатионредуктазой; в) цистамин (2,2'-диаминодиэтилдисульфид, 2,2'-дитиобис[этиламин] ) в концентрации 0,1 или любые другие фармацевтически приемлемые компоненты, способные вызывать обратимое ингибирование восстановления НАДФ⁺ в НАДФ·Н, катализируемое глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой или другими ферментами.

Вместе с тем, были получены данные, свидетельствующие о возможности прямого противоопухолевого эффекта GSSG или GSSG, применяемого в составе фармацевтически приемлемых композиций, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в биологических средах в окисленной форме. При этом действие GSSG проявляется дифференцированным эффектом относительно нормальных и опухолевых клеток. Исследования в условиях in vitro с применением нормальных и опухолевых клеток свидетельствует о том, что использование GSSG или GSSG, применяемого в составе фармацевтически приемлемых композиций, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в биологических средах в окисленной форме, сопровождается инициацией гибели опухолевых клеток по апоптотическому механизму. При этом, в случае использования нормальных клеток, их гибели не наблюдалось.

Согласно изобретению способ лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, включает парентеральное введение GSSG как фармакологического средства в виде инъекционной лекарственной формы в дозах 0,01 0,5 мг GSSG на кг массы тела, от одной и более инъекций в день, курсами длительностью один и более дней или непрерывно до момента достижения лечебного эффекта.

При этом, GSSG как фармакологическое средство, его лекарственные формы и/или фармацевтические композиции с его участием должны вводиться в организм исключительно парентеральным путем, что исключает или минимизирует деградацию молекулы GSSG или ее восстановление (до GSH), интенсивно протекающее в пищеварительном тракте и печени при его пероральном введении.

При использовании молекулы GSSG, защищенной от протеолиза и/или восстановления в GSH, целесообразным было бы использование перорального пути введения и/или локального (in situ) применения в зоне патологического процесса (раневая поверхность, ткань опухоли и т. д.). Помимо этого, предлагаемый способ лечения заболеваний с целью усиления или продления действия предлагаемого фармакологического средства может включать одновременное осуществление химического воздействия (прооксидантноактивными окислителями; соединениями, влияющими на активность ферментов и кофакторов, участвующих в метаболизме окисленного и восстановленного глутатиона) и/или физического воздействия, например УФ- или радиоблучения, в том случае, если подобное воздействие было бы способно продлить пребывание глутатиона в биологических жидкостях и тканях в окисленном состоянии.

Приводимые далее примеры реализации изобретения подтверждают, что парентеральное (внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное и т. д.) применение GSSG способно стимулировать эндогенную продукцию TNF-a, IFN-a и IFN-g, IL-1, IL-2, IL-6 и IL-10, эритропоэтина и GM-CSF у млекопитающих, что позволяет добиться существенного лечебного эффекта у людей и животных, страдающих онкологическими или инфекционными заболеваниями, депрессиями кроветворения и иммунитета различного происхождения, а также другими заболеваниями, при которых стимуляция эндогенной продукции вышеупомянутых цитокинов и гемопоэтических факторов была бы целесообразной по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Из данных проведенных исследований (см. примеры реализации изобретения) следует, что неизвестная ранее способность GSSG усиливать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов и оказывать лечебный эффект при различных заболеваниях не связана с повышением уровня GSH, поскольку использование GSH в широком диапазоне доз и концентраций не позволяет достичь стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, а также лечебного эффекта, который был обнаружен при использовании GSSG.

При этом, под "лечебным эффектом" понимается любое улучшение в состоянии пациента или животного, подвергнутого лечению по предлагаемому способу, а также любое снижение тяжести проявлений и выраженности симптомов заболеваний или их осложнений, в том числе вызванных другими методами лечения (например химио- или радиотерапией), которые могли бы быть зафиксированы с помощью физикальных, лабораторных или инструментальных методов обследования и были бы статистически достоверны и/или клинически значимы с точки зрения специалиста в соответствующей области медицины.

Под "профилактическим эффектом" понимается предупреждение любого ухудшения в состоянии субъекта, подвергнутого лечению по предлагаемому способу, а также предупреждение любого нарастания тяжести проявлений и выраженности симптомов заболеваний или их осложнений, в том числе вызванных другими методами лечения (например химио- или радиотерапией), которые могли бы быть зафиксированы с помощью физикальных, лабораторных или инструментальных методов обследования и были бы статистически достоверны и/или клинически значимы с точки зрения специалистов в соответствующей области медицины.

Под "онкологическими и инфекционными заболеваниями", "депрессией кроветворения и иммунитета различного происхождения" и "другими заболеваниями" понимаются любые онкологические или инфекционные заболевания, любые состояния, вызванные или сопровождающиеся угнетением красного или белого ростка кроветворения или депрессией количественных или функциональных показателей системы иммунитета, а также любые другие заболевания и патологические состояния, при которых стимуляция эндогенной продукции вышеупомянутых цитокинов и гемопоэтических факторов (TNF-a, IFN-a и IFN-g, IL-1, IL-2, IL-6 и IL-10, эритропоэтина и GM-CSF) была бы целесообразной по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Приведенные ниже примеры реализации изобретения демонстрируют возможность его практической применимости.

Активное вещество пептид GSSG, обладающий способностью стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, может быть получен известным и общепринятым методом пептидного синтеза. Полученный таким образом пептид (GSSG) с целью его дальнейшего применения в условиях in vivo у людей и животных используется в виде основания или фармацевтически приемлемой соли в инъекционной лекарственной форме, получаемой путем растворения сухого вещества в стерильной воде для инъекций или любом фармацевтически приемлемом растворителе в концентрации 0,01 2,0 Для исследований в условиях in vitro GSSG может растворяться в приемлемых для проведения соответствующих экспериментов жидкостях культуральных средах, изотонических солевых растворах и т. д.

Приготовление лекарственной формы для применения у людей и животных должно выполняться с соблюдением условий стерильности и апирогенности и должно исключать возможность химического или бактериального загрязнения лекарственной формы.

Инъекционная лекарственная форма GSSG была исследована в экспериментах на животных и в ходе ограниченных клинических исследований у больных людей.

Благодаря использованию максимально достижимой концентрации инъекционного раствора натриевой соли GSSG (10,0 100 мг/мл) в воде, в 0,003 растворе перекиси водорода или в 0,1 растворах гипоксантинрибозида или цистамина, а также благодаря использованию максимально допустимых объемов жидкости, инъецируемых мышам при внутрибрюшинном (в/б, 2,0 мл), внутривенном (в/в, 0,5 мл) и внутримышечном (в/м, 0,05 мл) введении, были достигнуты дозы натриевой соли GSSG, составляющие 5000 мг/кг (в/б), 625 мг/кг (в/в) и 62,5 мг/кг (в/м), что превышает максимальную дозу, рекомендуемую для человека и составляющую 0,5 мг/кг, в 500, 125 и 12,5 раз соответственно. Ни в одном из случаев не отмечалось гибели животных, а также каких-либо токсических проявлений, что фактически свидетельствует о нетоксичности GSSG, используемого в лекарственной форме раствора для инъекций, а также о нетоксичности применявшихся фармацевтических композиций, содержащих GSSG.

Результаты доклинических (экспериментальных) исследований биологических, фармакологических и лечебных свойств GSSG, а также его лекарственных форм, содержащих или не содержащих 0,003 растворе перекиси водорода, 0,1 растворе гипоксантинрибозида или 0,1 растворе цистамина, приведены в примерах 1 5 реализации изобретения.

Пример 1. Влияние исследуемых веществ на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека в условиях in vitro.

Оценивали способность окисленного глутатиона (GSSG), а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида или GSSG в 0,1 растворе цистамина влиять на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека в условиях in vitro.

Продукцию цитокинов лейкоцитами инициировали добавлением митогена, конканавалина А (ConA), который добавлялся к клеткам перед внесением в культуру исследуемых веществ. Супернатанты культур собирали через 24 ч после начала сочетанного воздействия ConA и исследуемых веществ и хранили до момента определения цитокинов при -70^oC.

Для оценки функционального состояния клеток и их способности претерпевать митоген-индуцированную активацию в присутствии каждой из оцениваемых концентраций исследуемых веществ контрольные культуры клеток, содержащие исследуемые вещества в идентичных концентрациях, инкубировали в течение 72 ч после начала сочетанного воздействия ConA и исследуемых веществ. За 16 ч до окончания инкубации в контрольные культуры вносили ³H-тимидин и степень включения метки в ДНК расценивали как критерий функционального состояния клеточной тест системы.

Венозную кровь от здоровых доноров (мужчин) собирали в гепаринизированные пробирки, тестированные на отсутствие эндотоксина (endotoxin tested). Мононуклеарную фракцию лейкоцитов крови получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-метризоат (Histopaque, Sigma).

Концентрацию клеток доводили до 2·10⁶ клеток на 1 мл "полной" культуральной среды (RPMI 1640, Sigma), содержащей 20 mM HEPES, 2 mM глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10 фетальной телячьей сыворотки (все реагенты для культур тканей, Sigma). Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим и клеточную суспензию разносили в лунки плоскодонных 96-луночных планшетов для культур тканей из расчета 200000 клеток на лунку (по 100 мл суспензии). Клетки от каждого донора разносили не менее чем в 36 лунок.

Оценивали влияние 5 конечных концентраций (5000 mг/мл, 500 μг/мл, 50 μг/мл, 5 μг/мл и 0,5 μг/мл) окисленного глутатиона (GSSG) или GSSG в сочетании: а) с перекисью водорода в конечной концентрации 0,003 б) с гипоксантинрибозидом в конечной концентрации 0,1 в) с цистамином в конечной концентрации 0,1 Каждую из концентраций создавали не менее чем в 6 лунках, внося 50 μл "полной" культуральной среды, содержащей необходимое количество предварительно растворенных веществ. Еще 6 лунок использовались для контроля (добавлялось 50 μл только "полной" культуральной среды или полной среды, содержащей перекись водорода, гипоксантинрибозид, цистамин).

Непосредственно после внесения исследуемых веществ во все лунки (за исключением 3-х контрольных) вносили по 50 μл "полной" культуральной среды, содержащей такое количество ConA (Sigma, для культур тканей), чтобы его конечная концентрация составляла 4,0 μг/мл.

Через 24 ч инкубации планшетов при 37^oC в присутствии 5 CO₂ содержимое половины лунок (по 3 лунки из каждых 6, содержащих одинаковую концентрацию исследуемых веществ) отсасывали микропипеткой, подвергали центрифугированию, супернатанты замораживали и хранили при -70^oC до момента проведения ELISA тестов для определения присутствия цитокинов. Содержимое всех оставшихся заполненными лунок продолжали инкубировать при вышеописанных условиях.

Через 56 ч от начала инкубации во все оставшиеся лунки добавляли по 1,0 μCi³H-тимидина и продолжали инкубацию еще 16 ч, после чего содержимое лунок при помощи клеточного харвестера (cell harvester) наносили на стекловолокнистые фильтры, которые последовательно обрабатывали 5 трихлоруксусной кислотой и этанолом. Фильтры высушивали и их радиоактивность определяли с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика Betaplate 1205 (LKB).

Значения радиоактивности фильтров для каждого триплета лунок усредняли и рассчитывали индекс митогенной стимуляции по отношению к усредненному значению включения ³H-тимидина в триплете лунок, в которые не добавлялся ConA (спонтанное включение метки). По индексу стимуляции отношению усредненного ConA-стимулированного включения в трех контрольных лунках к усредненному спонтанному судили о функциональном состоянии клеток в данных лунках в присутствии оцениваемых концентраций GSSG (или GSSG в сочетании с перекисью водорода, гипоксантинрибозидом, цистамином) и об их способности отвечать на митогенную стимуляцию.

Последующему анализу на содержание цитокинов подвергали клеточные супернатанты 24-часовых культур только из тех триплетов лунок, в контрольных триплетах которых при 72-часовой инкубации индекс ConA-стимуляции, оцененной по включению ³H-тимидина, был не ниже 10, что свидетельствовало об удовлетворительном функциональном состоянии клеток.

Содержание интерлейкина-lb (IL-1 b); интерлейкина-6 (IL-6); фактора некроза опухолей α(THFα) и интерферона a(IFNα) определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов фирмы Medgenix (Belgium) и выражали в пкг/мл культуральной среды.

Результаты представлены в табл. 1 4. Согласно данным табл. 1 4 добавление GSSG в культуральную среду статистически достоверно и дозозависимо усиливает выработку цитокинов мононуклеарными лейкоцитами доноров. При этом, дополнительное присутствие перекиси водорода приводит к тому, что повышаются контрольные (в отсутствие GSSG) показатели продукции IL-6 и TNFα. Кроме того, в присутствии перекиси водорода GSSG оказывает более выраженное (в 1,5 2 раза) стимулирующее влияние на продукцию исследуемых цитокинов: для IL-1b в концентрациях 5,0 5000 mг/мл, для IL-6 и TNFα во всем диапазоне концентраций и для IFNα в концентрациях 500 и 5000 mг/мл. Применение GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и 0,1 растворе цистамина приводит к достоверному и дозозависимому повышению продукции цитокинов, особенно в отношении IL-6 и TNFα (см. табл. 3 и 4).

Таким образом, действие GSSG на мононуклеарные лейкоциты периферической крови людей в условиях in vitro приводит к убедительной стимуляции продукции цитокинов в культуральную среду, чем подтверждается стимулирующее действие GSSG на естественную цитокин-продуцирующую способность клеток крови человека. Использование GSSG в комбинации с перекисью водорода, гипоксантинрибозидом, также цистамином, приводит к более выраженному проявлению цитокинактивирующих эффектов GSSG.

Пример 2. Влияние исследуемых веществ на продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, а также показатели кроветворения и иммунитета при циклофосфановой гемо- и иммунодепрессии.

Действие окисленного (GSSG) и восстановленного (GSH) глутатиона, а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида или GSSG в 0,1 растворе цистамина, оценивали в модели гемо- и иммунодепрессии у мышей, индуцированной однократным введением цитостатика, циклофосфамида (ЦФ).

В рамках данного исследования была проведена оценка влияния 5-дневного применения вышеперечисленных веществ на способность лимфоцитов селезенки мышей, подвергнутых действию ЦФ, продуцировать IL-2 и GM-CSF в условиях in vitro. Помимо этого, оценивалась клеточность крови (число лейкоцитов и лимфоцитов) и костного мозга (число кариоцитов) на 8-й день после применения ЦФ. У части животных, получивших УФ и затем подвергнутых иммунизации эритроцитами барана (ЭБ), оценивали способность развивать гуморальный иммунный ответ к данному антигену.

Исследование было проведена на мышах линии СВА (самцах) массой 18 20 г, которым однократно вводился ЦФ (50 мг/кг, внутрибрюшинно). Семь групп животных (не менее 15 мышей в каждой) было сформировано в рамках проведенного исследования.

Описание групп.

Контрольные группы:
N1 интактные животные, получившие вместо инъекции ЦФ инъекцию физиологического раствора;
N2 животные, получившие инъекцию ЦФ, у которых в дальнейшем применялся физиологический раствор (контроль);
N3 животные, получившие инъекцию ЦФ, у которых в дальнейшем применялся GSH в физиологическом растворе из расчета 5 мг/кг массы тела (вещество сравнения).

Опытные группы:
N4 животные, получившие инъекцию ЦФ, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе из расчета 5 мг/кг массы тела (исследуемое вещество);
N5 животные, получившие инъекцию ЦФ, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,003 перекиси водорода из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
N6 животные, получившие инъекцию УФ, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,1 гипоксантинрибозида, из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
N7 животные, получившие инъекцию ЦФ, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,1 цистамина, из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества).

Через 24 ч после применения ЦФ по 5 животных из каждой группы было подвергнуто иммунизации эритроцитами барана (ЭБ, 10⁷ эритроцитов в 0,5 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно).

С начала 3-х суток после инъекции ЦФ (у иммунизированных животных через 24 ч после иммунизации) животным начинали внутрибрюшинное введение контрольных или исследуемых веществ, как описано выше. Введение веществ продолжали в течение 5 дней (ежедневно, один раз в день).

Через 24 ч после окончания применения контрольных или исследуемых веществ (на 8-й день после инъекции ЦФ) мышей эфтаназировали и в стерильных условиях готовили суспензию спленоцитов для оценки спонтанной продукции IL-2 и GM-CSF лимфоцитами селезенки в условиях in vitro.

Параллельно с этим забирали образцы крови и костного мозга для оценки их клеточности (число лейкоцитов и лимфоцитов крови, кариоцитов костного мозга).

У иммунизированных животных на 7-й день после иммунизации (8-й день после инъекции ЦФ) оценивали сывороточный титр гемагглютининов к ЭБ.

В табл. 5 приведены показатели продукции IL-2 и GM-CSF спленоцитами, показатели клеточности крови и костного мозга и уровень гуморального иммунного ответа на эритроциты барана у мышей, получавших исследуемые вещества на фоне циклофосфан-индуцированной гемо- и иммунодепрессии.

Согласно данным, представленным в табл. 5, применение GSSG и GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода практически нормализует продукцию IL-2 и GM-CSF клетками селезенки, тогда как GSH не обладает подобным действием. При этом GSSG и GSSG в растворе перекиси водорода оказывают достоверное восстанавливающее действие на клеточность крови и костного мозга и способность животных формировать иммунный ответ к ЭБ.

В табл. 6 и 7 представлены результаты оценки влияния фармацевтически активных композиций (в составе GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и GSSG в 0,1 растворе цистамина) на динамику исследуемых показателей в условиях ЦФ-индуцированной гемо- и иммунодепрессии. Приведенные данные свидетельствуют о существенном усилении эффектов GSSG такими компонентами как гипоксантинрибозид и цистамин относительно стимуляции продукции IL-2 GM-CSF, восстановления клеточности крови и костного мозга. При этом, как можно видеть, GSH не обладал подобным действием, а максимальный эффект был выявлен в случае сочетания GSSG и 0,1 гипоксантинрибозида.

Таким образом, применение предлагаемого способа у животных, подвергнутых химической (циклофосфамид индуцированной) гемо- и иммунодепрессии, приводит к выраженной стимуляции эндогенной продукции IL-2 и GM-CSF; оказывает восстанавливающее действие на клеточность крови и костного мозга, а также формирует эффективный иммунный ответ организма.

Пример 3. Влияние исследуемых веществ на продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, а также показатели кроветворения и иммунитета при радиационной гемо- и иммунодепрессии.

Действие окисленного (GSSG) и восстановленного (GSH) глутатиона, а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и GSSG в 0,1 растворе цистамина, оценивалось в модели радиационной гемо- и иммунодепрессии у мышей, индуцированной однократным облучением в общей дозе 1 Гр.

В рамках данного исследования была проведена оценка влияния 7-дневного ежедневного применения вышеперечисленных веществ (первое введение препаратов через 2 ч после облучения) на способность лимфоцитов селезенки мышей, подвергнутых радиационному воздействию, продуцировать IL-2 и GM-CSF в условиях in vitro. Помимо этого оценивалась клеточность крови (число лейкоцитов и лимфоцитов), селезенки и костного мозга (число кариоцитов) на 8-й день после облучения, а также колоние-образующая способность клеток костного мозга и селезенки.

Исследование было проведено на мышах линии СВА (самцах) массой 18 20 г, которые были подвергнуты однократному рентгеновскому обучению в общей дозе 1 Гр (расстояние от источника 70 см, мощность 180 кВ, 15 мА, фильтр 0,5 Cu, длительность облучения 2 мин 28 с).

Семь групп животных (не менее 12 мышей в каждой) было сформировано в рамках проведенного исследования.

Описание групп.

Контрольные группы:
N1 интактные животные, получившие стрессорное воздействие в виде ложного облучения, у которых в дальнейшем применялся физиологический раствор (интактные);
N2 животные, облученные в дозе 1 Гр, у которых в дальнейшем применялся физиологический раствор (контроль);
N3 животные, облученные в дозе 1 Гр, у которых в дальнейшем применялся GSH в физиологическом растворе из расчета 5 мг/кг массы тела (вещество сравнения).

Опытные группы:
N4 животные, облученные в дозе 1 Гр, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе из расчета 5 мг/кг массы тела (исследуемое вещество);
N5 животные, облученные в дозе 1 Гр, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,003 перекиси водорода из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
N6 животные, обученные в дозе 1 Гр, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,1 гипоксантинрибозида из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
N7 животные, облученные в дозе 1 Гр, у которых в дальнейшем применялся GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,1 цистамина из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
Через 2 ч после облучения животным начинали внутрибрюшинное введение контрольных или исследуемых веществ, как описано выше. Введение веществ продолжали в течение 7 дней (ежедневно, один раз в день).

Через 24 ч после окончания применения контрольных или исследуемых веществ (на 8-й день после облучения) мышей эфтаназировали и в стерильных условиях готовили суспензию спленоцитов для оценки спонтанной продукции IL-2 и GM-CSF лимфоцитами селезенки в условиях in vitro
Параллельно с этим забирали образцы крови, селезенки и костного мозга для оценки их клеточности (число лейкоцитов и лимфоцитов крови, кариоцитов селезенки и костного мозга).

Одновременно, определяли гемопоэтическую способность клеток костного мозга и селезенки методом прямой оценки колоние-образующих единиц в селезенке сингенных облученных реципиентов, которым внутривенно вводили порции исследуемых суспензий клеток костного мозга и селезенки от животных исследуемых групп.

В табл. 8, 9, 10 приведены показатели продукции IL-2 и GM-CSF спленоцитами, показатели клеточности крови, селезенки и костного мозга, а также показатели колоние-образования (колоние-образующие единицы, КОЕ) костного мозга и селезенки обученных животных на 8 день после радиационного воздействия.

Как следует из материалов табл. 8 10, применение GSSG, а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и GSSG в 0,1 растворе цистамина статистически достоверно восстанавливает продукцию IL-2 и GM-CSF клетками селезенки, тогда как GSH не оказывает существенного эффекта. При этом, как GSSG, так и GSSG в составе фармацевтически активных композиций оказывали достоверное нормализующее действие на клеточность крови, селезенки и костного мозга. В ряде случаев эффект GSSG в растворе перекиси водорода оказался более существенным. Так, в случае применения GSSG эффект данного вещества не имел статистической значимости (при сравнении с контрольной группой) для таких показателей как продукция IL-2 спленоцитами, лейкоциты крови и клеточность костного мозга, а также колоние-образующая активность клеток костного мозга, тогда как в случае использования GSSG в растворе перекиси водорода, статистически достоверные отличия имели место.

Более выраженными эффектами в сравнении с перекисью водорода обладали гипоксантинрибозид и цистамин, которые более существенно потенцировали действие GSSG, при этом максимальный эффект оказывала фармацевтически активная композиция GSSG с гипоксантинрибозидом.

Таким образом, применение предлагаемого способа у животных, подвергнутых радиационной гемо- и иммунодепрессии, приводит к выраженной стимуляции эндогенной продукции IL-2 и GM-CSF, нормализации клеточности крови, лимфоидных и кроветворных органов, а также восстановлению гемопоэтической активности костного мозга и селезенки.

Пример 4. Влияние исследуемых веществ на процессы пролиферации и апоптотической гибели нормальных и трансформированных клеток.

Оценивали способность окисленного глутатиона (GSSG), а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и GSSG в 0,1 растворе цистамина влиять на процессы пролиферации и апоптотической гибели нормальных и трансформированных клеток. Для этого осуществляли инкубацию GSSG или GSSG в составе фармацевтически активных композиций в течение 24 ч с клетками миелоидной линии HL-60 и лимфоцитами доноров с последующей оценкой клеточного цикла методом проточной цитофотометрии.

Венозную кровь от здоровых доноров (мужчин) собирали в гепаринизированные пробирки, тестированные на отсутствие эндотоксина. Мононуклеарную фракцию лейкоцитов крови получали центрифугированием в градиенте плотности фиколлметризоат (Histopaque, Sigma). Концентрацию клеток доводили до 2·10⁶ клеток на 1 мл полной культуральной среды (RPMI 1640), содержащей 20 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10 эмбриональной телячьей сыворотки. Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим и клеточную суспензию разносили в лунки 96-луночных планшетов из расчета 200 000 клеток на лунку.

Клетки перевиваемой миелоидной линии HL-60 выращивались в среде RPMI 1640 с добавкой 10 эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводили в закрытых флаконах, объем среды 12 мл, смену среды проводили каждые 4 дня путем центрифугирования. Характер роста клеток суспензионный.

Оценивали влияние раствора GSSG (5 мг/мл), а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и GSSG в 0,1 растворе цистамина. Каждый из растворов оценивали по 6 пробам для нормальных лимфоцитов и клеток HL-60.

Растворы тестируемых веществ (GSSG или GSSG в составе фармацевтически активных композиций) в количестве 50 мкл добавлялись в культуральную среду и клетки культивировали в течение 1 сут. Затем они тестировались с помощью проточной цитофлюориметрии на предмет содержание ДНК в клеточных ядрах. В случае наступления апоптотической гибели наблюдалось уменьшение доли клеточных ядер с нормальным содержанием ДНК и увеличивалось число фрагментов ядер с существенно меньшим содержанием ДНК. Процедура анализа заключалась в следующем: клетки центрифугированием переводились в стандартный фосфатный изотонический буфер pH 7,4, содержащий РНК-азу А (20 мкг/мл), флюоресцентный краситель бромистый этидий (10 мкг/мл) и MgCl₂ (5 мМ). Затем клетки вскрывались добавлением не ионного детергента Triton X-100 (конечная концентрация 0,1 ). Полученная в результате суспензия клеточных ядер анализировалась на проточном цитофлюориметре с аргоновым лазером в качестве источника света (длина волны возбуждающего цвета 488 нм). Регистрируемая красная флюоресценция связанного с ДНК бромистого этидия является мерой содержания ДНК в ядрах клеток.

Параллельно визуально анализировались изменения в морфологии изучаемых клеток.

Результаты исследования влияния GSSG (или GSSG в составе фармацевтически активных композиций) на пролиферативную активность лимфоцитов доноров представлены в табл. 11. Как можно видеть из данных табл. 11, добавление GSSG или GSSG в составе фармацевтически активных композиций стимулирует пролиферацию лимфоцитов здорового человека, что приводит к увеличению их общего количества. При этом проточный цитофлюориметрический анализ не обнаружил появления пула клеток с характерными апоптотическими изменениями (см. фиг. 3, 4).

Исследования, проведенные на клеточных культурах трансформированных клеток миелоидной линии HL-60, выявили способность GSSG (или GSSG в составе фармацевтически активных композиций) тормозить пролиферацию трансформированных клеток используемой линии (см. табл. 12). Данные табл. 12 показывают, что композиции с перекисью водорода, гипоксантинрибозидом и цистамином обладают существенно большей способностью ингибировать пролиферацию клеток HL-60 в сравнении с GSSG, применяемым в монорежиме. Проведенный проточный цитофлюориметрический анализ показал, что уменьшение клеточного роста клеток линии HL-60 сопровождается появлением характерных морфологических признаков апоптотической гибели: клетки из сферических становились многолопастными с множественными перетяжками; отмечалось уменьшение клеточных ядер с нормальным содержанием ДНК; увеличивалось число фрагментов ядер с существенно сниженным содержанием ДНК (см. фиг. 1 4).

Таким образом, проведенные in vitro исследования позволяют говорить о наличии бифункциональной активности GSSG, а также GSSG в составе фармацевтически активных композиций, увеличивающих время пребывания данного соединения в окисленном состоянии, по отношению к опухолевым и нормальным клеткам. GSSG или GSSG в составе фармацевтически активных композиций избирательно вызывает апоптотическую деградацию ДНК в трансформированных клетках и замедляет их пролиферацию, при этом подобный эффект отсутствует для нормальных клеток (лимфоцитов доноров), а пролиферация последних отчетливо ускоряется. Использование GSSG в комбинации с гипоксантинрибозидом приводит к более выраженному эффекту GSSG.

Пример 5. Влияние исследуемых веществ на рост перевиваемых опухолей у мышей.

Исследовалась противоопухолевая активность окисленного глутатиона (GSSG), а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида, GSSG в 0,1 растворе цистамина, на двух моделях опухолевого процесса, индуцированного введением в организм мышей клеток лейкемии Р388 и лейкемии L1210. В рамках данного исследования оценивалось влияние 7-дневного применения вышеназванных препаратов на динамику содержания цитокинов (IL-1; IL-2; IL-6; IFN-альфа; TNF) в крови мышей с перевитыми опухолями и у контрольных животных. Параллельно оценивали динамику накопления асцитической жидкости в качестве показателя опухолевой прогрессии и среднюю продолжительность жизни в контрольной и подопытной группах в качестве интегрального показателя противоопухолевой активности исследуемых препаратов.

Исследование проводилось на мышах линии DBA/2 поскольку данные животные являются сингенными по отношению к перевиваемым штаммам опухолевых клеток (Р388 и L1210). Масса тела животных в начале исследований составляла 18 21 г.

Предварительно проводили пассаж каждой из линий опухолевых клеток на 6 животных. Для этого культуры клеток, хранящиеся при температуре жидкого азота, размораживали и разводили в стерильном растворе Хенкса до концентрации 5·10⁶ кл./мл, 0,2 мл полученной суспензии клеток каждой линии внутрибрюшинно инокулировали 6 мышам.

На 8-й день пассажа в случае клеток Р388 и на 6-й день пассажа в случае клеток L1210 из брюшной полости извлекали асцитную жидкость и полученные образцы опухолевых клеток были использованы для проведения основных экспериментов. День получения асцитной жидкости считался днем окончания пассажа и являлся днем начала основного эксперимента. Асцитную жидкость разводили стерильным раствором Хенкса до концентрации 5·10⁶ кл./мл в случае клеток Р388 и до концентрации 5·10⁵ кл./мл в случае клеток L1210.

Для исследований с каждой из опухолевых линий были сформированы по 8 групп животных не менее 15 мышей в каждой. Объем инокулируемой суспензии составил 0,2 мл на мышь, доза инокулюма: 10⁶ кл./мышь в случае клеток Р388 и 10⁵ кл./мышь в случае клеток L1210.

Через 24 ч после инокуляции опухолевых клеток животным начинали внутрибрюшинное введение исследуемых веществ и веществ сравнения. Далее инъекции исследуемых веществ и веществ сравнения продолжали до 14-го дня исследования включительно или до момента гибели животного. Объем инъекции - 0,01 мл/г массы тела животного.

Для экспериментов с каждой из опухолевых линий было сформировано по 9 групп животных, описание которых приведено ниже.

Контрольные группы:
N1 интактные животные, получившие вместо инъекции опухолевых клеток инъекцию физиологического раствора, который вводился им в дальнейшем (интактные);
N2 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился физиологический раствор.

Опытные группы:
N3 животные, получившие инъекции опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился GSSG в физиологическом растворе из расчета 5 мг/кг массы тела;
N4 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,003 перекиси водорода из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
N5 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,1 гипоксантинрибозида из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции Исследуемого вещества);
N6 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился GSSG в физиологическом растворе, содержащем 0,1 цистамина из расчета 5 мг GSSG на кг массы тела (вариант фармацевтически активной композиции исследуемого вещества);
N7 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился 0,003 раствор перекиси водорода (компонент фармацевтически активной композиции в качестве контроля исследуемой композиции);
N8 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился 0,1 раствор гипоксантинрибозида (компонент фармацевтически активной композиции в качестве контроля исследуемой композиции);
N9 животные, получившие инъекцию опухолевых клеток, которым в дальнейшем вводился 0,1 раствор цистамина (компонент фармацевтически активной композиции в качестве контроля исследуемой композиции).

В табл. 13 и 14 приведены показатели влияния исследуемых веществ на эндогенную продукцию цитокинов, а также интегративные показатели прогрессии опухолевого процесса. Анализ материалов табл. 13 и 14 свидетельствует о том, что GSSG, а также GSSG в составе фармацевтически активных композиций, увеличивающих время пребывания данного соединения в окисленном состоянии, обладают отчетливым цитокинактивирующим действием, достоверно (относительно контрольных групп) тормозят накопление асцитической жидкости и увеличивают среднюю продолжительность жизни животных, носителей опухоли. При этом лекарственные формы GSSG и GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода в большей степени повышают содержание в крови IL-1 и IFNα, а GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и GSSG в 0,1 растворе цистамина обуславливают большую наработку IL-2, IL-6, TNFα.

Максимальный уровень таких показателей противоопухолевого действия исследуемых веществ как торможение накопления асцита и продолжительность жизни получена в обеих моделях опухолевого процесса (лейкемия Р388 и L1210) в случае применения GSSG в 0,1 растворе цистамина.

Таким образом, применение предлагаемого способа для лечения мышей с перевитыми опухолями приводит
к выраженной стимуляции эндогенной наработки цитокинов IL-2, IL-6, IFNα и TNFα;
к достоверному торможению роста перевиваемых опухолей, а также к торможению прогрессии опухолевого процесса и увеличению продолжительности жизни подопытных животных.

Неизвестные ранее свойства GSSG и его фармацевтически активных композиций, содержащих 0,003 раствор перекиси водорода, 0,1 раствор гипоксантинрибозида или 0,1 раствор цистамина, установленные в ходе экспериментальных, доклинических исследований, позволяют утверждать, что GSSG, его лекарственные формы, а также фармацевтически активные композиции с его участием обладают выраженной фармакологической активностью и лечебным эффектом. Это обосновывает показания к применению соответствующих лекарственных форм GSSG, а также GSSG в составе фармацевтически активных композиций для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.

Примеры клинического применения лекарственных форм GSSG, приведенные далее (см. примеры 6 12), подтверждают возможность использования GSSG как стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэза, а также фактора воспроизведения эффектов цитокинов у людей, в том числе для реализации способа лечения заболеваний, основанного на данных свойствах GSSG, в клинических условиях.

Пример 6. Влияние применения лекарственной формы GSSG на эндогенную продукцию цитокинов и эритропоэтина у людей, страдающих онкологическими заболеваниями.

В данном примере приведены сведения, касающиеся стимулирующего действия GSSG на эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов у людей, страдающих онкологическими заболеваниями. Раствор GSSG (5 мг/мл) вводился внутривенно, медленно, один раз в два дня, в дозе 5 мг на одну инъекцию. Об эндогенной продукции цитокинов судили по их содержанию в крови пациентов перед первой инъекцией (кровь собирали за 24 ч до момента введения), а также после третьей и седьмой инъекций GSSG. Содержание цитокинов определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов фирмы Medgenix (Belgium) и выражали в пкг/мл культуральной среды.

По данным, представленным в табл. 15, можно судить о том, что уже после трех первые инъекций GSSG отмечается выраженная стимуляция эндогенной продукции цитокинов (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa) и эритропоэтина. После 7-й инъекции (14 дней лечения) в большинстве случаев отмечается многократный прирост содержания цитокинов и эритропоэтина в крови пациентов.

Пример 7. Стимуляция эндогенной продукции цитокинов и эритропоэтина и лечебный эффект у больной раком сигмовидной кишки, осложненным гемодепрессией, вызванной химиотерапевтическим лечением.

Больная 44 лет была прооперирована по поводу опухоли сигмовидной кишки с прорастанием в яичник и метастатическим поражением лимфатических узлов брыжейки и большого сальника (T₄N₃M₁). В послеоперационном периоде был проведен курс химиотерапии 5-фторурацилом (курсовая доза 5,5 г), сопровождавшийся выраженным гематотоксическим эффектом.

Через 1 месяц после проведенного курса химиотерапии больная была повторно обследована с проведением ультразвукового исследования органов брюшной полости, а также компьютерной томографии печени, которые выявили одиночный метастаз в левой доле печени, овальной формы, размером 13 х 10 см. При повторных клинических анализах крови у больной было обнаружено неполное восстановление показателей крови (регистрировались различные степени лейко- и лимфопении, анемии и тромбоцитопении), что делало невозможным проведение новых курсов химиотерапии.

Результаты клинико-иммунологического обследования до начала применения лекарственной формы окисленного глутатиона (5 мг GSSG в 1 мл 0,003 перекиси водорода) приведены в табл. 16. Лечение по предлагаемому способу было начато с внутривенных инъекций по 5 мг GSSG однократно в течение 7 дней. После 3-дневного перерыва доза препарата GSSG была увеличена до 15 мг, внутривенно, однократно в течение 10 дней. После 7-дневного перерыва препарат GSSG вводили внутримышечно по 15 мг, через день (всего 20 инъекций).

Через 50 дней после начала лечения по предлагаемому способу пациентке было проведено повторное ультразвуковое обследование органов брюшной полости и компьютерная томография печени, которые выявили существенную регрессию размеров одиночного метастаза в левой доле печени (более 50 от исходного). Результаты клинико-иммунологического исследования, выполненного после проведенного лечения, приведены в табл. 16.

Как можно видеть, по окончании лечения значительно улучшились показатели красной и белой крови, практически нормализовалось число тромбоцитов, снизилось СОЭ, значительно повысилось число CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов, NK-клеток). Произошла убедительная стимуляция эндогенной продукции цитокинов и эритропоэтина, в том числе фактора некроза опухолей, с чем, наряду с ростом количества естественных киллеров, может быть связана регрессия метастаза в печени. Данные изменения сопровождались улучшением общего состояния больной, повышением физической активности.

Приведенное клиническое наблюдение свидетельствует об очевидной лечебной эффективности предлагаемого способа. В результате проведенного лечения на фоне существенной стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов выявлено уменьшение размеров метастаза в печени и нормализация клинико-иммунологических показателей, улучшение общего состояния пациентки.

Пример 8. Стимуляция эндогенной продукции цитокинов и лечебный эффект у больного СПИДом, осложненным криптококковым менингоэнцефалитом.

Мужчина 28 лет с подтвержденным ранее диагнозом СПИД, стадия 3/4С (WHO Staging System) поступил в состоянии средней тяжести. Жалобы на приступообразную головную боль, головокружение, рвоту. Вест тела 47 кг, индекс Карновского 60, заторможен, повышение температуры тела до 39^oC, одышка в покое. При неврологическом осмотре выявлены ригидность затылочных мышц, снижение сухожильных рефлексов верхних и нижних конечностей (коленных, ахилловых, двуглавой и трехглавой мышц). При исследовании спинномозговой жидкости обнаружен Cryptococcus neoformans, на основании чего было установлено наличие криптококкового менингоэнцефалита, стадия основного заболевания (СПИД) было уточнена как 4С.

Начата активная инфузионная терапия. Помимо симптоматических средств больной получил курс лечения фунгизоном (Amphotericin B), который не обеспечил должного эффекта. Выраженность неврологической симптоматики и состояние больного продолжали ухудшаться. Сохранялась фебрильная температура тела (37,5 38,5^oC).

К моменту начала применения лекарственной формы (5 мг/мл GSSG в 1 мл 0,003 перекиси водорода) у больного определялось резкое снижение количества CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов периферической крови, анемия, лимфопения (см. табл. 17).

Лечение больного по предлагаемому способу проводилось в течение 3-х месяцев (по 1 мл раствора GSSG на одну инъекцию). При этом, в течение первого месяца инъекции проводились через день (первые 10 дней внутривенно, в дальнейшем в/м), в течение 2-го месяца раз в три дня (первые 10 дней в/в, в дальнейшем п/к).

К середине первого месяца лечения состояние больного существенно улучшилось, уменьшилась выраженность неврологической симптоматики, температура тела не поднималась выше 37,5^oC. В ходе проведения лечения по предлагаемому способу больному дважды проводили микологическое исследование ликвора (цитологическое, культуральное, реакция латекс агглютинации на наличие криптококкового антигена). К концу первого месяца лечения было обнаружено существенное снижение присутствия в ликворе способных к росту организмов Cryptococcus neoformans. К исходу второго месяца цитологические, культуральные и иммунологические тесты показали отсутствие возбудителя в спинномозговой жидкости. В течение 3-го месяца в связи со значительным улучшением в состоянии больного инъекции проводились 1 раз в неделю (в/м).

Результаты клинико-иммунологического обследования больного по завершении лечения приведены в табл. 17. Как можно видеть, уменьшились проявления анемии, а также произошло существенное нарастание числа лимфоцитов и их субпопуляций, что позволяет констатировать рестадирование основного заболевания (СПИД) со стадии 4С в стадию 4В.

Обращает внимание убедительное нарастание содержания цитокинов в крови, ряд из которых (IL-2 и 6, IFNg) играют принципиальную роль в обеспечении механизмов защиты макроорганизма от патогенных грибов.

К моменту выписки из стационара состояние пациента расценивалось как удовлетворительное, вес тела 60 кг (прибавка в весе составила 21,7 от исходного), температура тела нормальная, индекс Карновского 90. Неврологическая симптоматика отсутствовала.

Пример 9. Стимуляция эндогенной продукции цитокинов и лечебный эффект у больного СПИДом, осложненным изоспорозом.

Мужчина 38 лет около 2 лет наблюдается с диагнозом СПИД, стадия 3С (WHO Staging System). В течение последнего года документированы повторные эпизоды кандидоза слизистой полости рта и пищевода, а также практически хроническое течение изоспороза кишечника, проявляющееся в снижении аппетита, тошноте, частых эпизодах рвоты и жидкого стула с примесью слизи и крови. Периодическое применение котримоксазола (триметоприм в комбинации с сульфаметоксазолом, TMP-SMX) давало нестойкие ремиссии с быстрым возобновлением симптоматики.

Очередное обострение изоспороза на протяжении последнего месяца. Курс терапии котримоксазолом, имодиумом (лоперамидом) практически без эффекта. Состояние постепенно ухудшалось: постоянная температура тела 38^oC и выше, жидкий стул с примесью крови и слизи до 6 7 раз в сутки, рвота, прогрессирующая потеря веса (за год около 15 от своего обычного веса). Госпитализирован в связи с прогрессирующим ухудшением состояния.

При поступлении в стационар общее состояние средней тяжести, индекс по шкале Карновского 50, температура тела 38,2^oC, больной истощен (вес 42 кг), подкожно-жировой слой практически отсутствует, кожные покровы бледные. Признаки кандидоза слизистой рта и пищевода. При повторных исследованиях кала обнаруживается большое количество ооцис Isospora belli.

К моменту начала лечения пациента по предлагаемому способу у больного определялась лимфопения, резкое снижение количества CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов, гипопротеинемия (см. табл. 18).

Лечение больного с применением лекарственной формы окисленного глутатиона (5 мг GSSG в 1 мл 0,003 перекиси водорода) проводилось в течение 3-х месяцев (по 1 мл композиции на одну инъекцию). При этом, в течение первого месяца инъекции выполнялись через день (первые 10 дней внутривенно, в дальнейшем в/м), в течение 2-го месяца раз в три дня (первые 10 дней в/в, в дальнейшем п/к).

Состояние больного начало отчетливо улучшаться после первых 2-х недель лечения. К концу первого месяца лечения частота стула не превышала 1 2 раз в день, без примеси крови, температура тела лишь эпизодически превышала 37,0^oC. К исходу второго месяца повторные исследования кала на наличие ооцист Isospora belli показали отсутствие возбудителя. В течение 3-го месяца в связи со значительным улучшение в состоянии проводились профилактическое применение лекарственной формы GSSG 1 раз в неделю (в/м). Реактивации заболевания не отмечено.

Результаты клинико-иммунологического обследования больного по завершении лечения приведены в табл. 18. Как можно видеть, уменьшились проявления гипопротеинемии, кроме того, произошло существенное повышение числа лимфоцитов и их субпопуляций, в результате чего картина крови после курса лечения соответствует 3В стадии по шкале ВОЗ (WHO Staging System), что позволяет констатировать растадирование основного заболевания (СПИД).

В данном случае также обращает внимание значительное нарастание содержания цитокинов в крови, при этом известно, что такие из них как IL-2 и IFNg играют важную роль в защите макроорганизма от протозойных инфекций.

После проведенного курса лечения общее состояние больного значительно улучшилось, уменьшилась слабость, улучшился аппетит. Прибавка в весе составил около 30 от исходного, индекс Карновского 90 баллов. При физикальном осмотре состояние больного расценивалось как удовлетворительное. В ходе наблюдения за больным в течение 1,5 месяцев после выписки из стационара рецидивов диареи не отмечено.

Пример 10. Стимуляция эндогенной продукции эритропоэтина и лечебный эффект у больного гипопластической анемией и панцитопенией.

Мужчина 37 лет наблюдается около года по поводу анемии неясного генеза, выраженность которой постепенно нарастает. В течение последних 10 месяцев постоянно беспокоят слабость, утомляемость, головокружения, частые носовые кровотечения, необычная подверженность респираторным инфекциям, трижды перенес пневмонию, при этом один раз крупозную. Отмечает, что за год потерял около 10 своего обычного веса. Повторные амбулаторные курсы лечения пероральными и внутривенными препаратами железа, фолиевой кислоты, а также препаратами В, в том числе В₁₂, без эффекта.

При поступлении в стационар состояние близко к средней тяжести, резкая слабость, одышка при умеренной физической нагрузке, отмечаются кровоподтеки на коже, отдельные петехиальные высыпания. В повторных анализах крови - среднетяжелая/тяжелая нормоцитарная анемия (эритроциты 1,5 - 2,5·10¹²/л) с тенденцией к гипохромии (цветовой показатель 0,7 - 0,9), анизо- и пойколицитоз, умеренная лейкопения, тромбоцитопения в пределах (50 80·10⁹/л).

Активная инфузионная терапия препаратами железа, фолиевой кислоты, цианкобаламином, витаминами, преднизолоном, повторные переливания эритоцитарной массы без отчетливого эффекта.

По данным миелограммы (трепанобиопсия) клеточность костного мозга резко снижена, межбалочные пространства заполнены преимущественно жировой тканью. Как миелоидный, так и эритроидный ростки, значительно угнетены, соотношение эритроидных и миелоидных клеток резко снижено. Мегакариоциты практически отсутствуют. Относительное повышение содержания недифференцированных и плазматических клеток, бластов. Запасы железа увеличены.

Диагноз: гипопластическая анемия неясного генеза, панцитопения.

Результаты клинического анализа крови и уровень эритропоэтина к моменту начала применения лекарственной формы окисленного глутатиона (5 мг GSSG в 1 мл 0,003 перекиси водорода) приведены в табл. 19. Как можно видеть, лабораторные данные соответствуют картине гипопластической анемии, однако характерное для данного типа анемии нарастание уровня эритропоэтина крови отсутствует. Более того, уровень эритропоэтина оказался значительно снижен относительно нижней границы нормы (9,2 пкг/мл при норме 30 170 пкг/мл, что в международных единицах соответствует 3 17 mIU/мл).

Применение лекарственной формы окисленного глутатиона (5 мг GSSG в 1 мл 0,003 перекиси водорода), было начато с внутримышечных инъекций по 1 мг GSSG 2 раза в день в течение 3 дней. Далее дозы были увеличены до 5 мг 2 раза в день в течение 7 дней. В анализах крови было отмечено уменьшение выраженности анемии. В дальнейшем композиция применялась по 10 мг GSSG внутримышечно 1 раз в день в течение 10 дней, после чего на фоне отчетливой позитивной динамики картины красной крови было начато внутривенное применение композиции: по 10 мг GSSG 1 раз в три дня, которое продолжалось в течение 30 дней. Сопутствующая терапия включала витамины и препараты железа перорально.

Результаты клинического анализа крови и уровень эритропоэтина крови через 50 дней от начала лечения по предлагаемому способу приведены в табл. 19. Как можно видеть картина красной и белой крови существенно улучшилась, наросло число тромбоцитов, снизилась СОЭ, уровень эритропоэтина превысил верхнюю границу нормы. Клинически у больного исчезли слабость, головокружения, одышка. При осмотре петехиальные кровоизлияния и кровоподтеки не выявляются, эпизодов носовых кровотечений не отмечалось. Прибавка в весе за время лечения составила 5,5 кг (что составило около 8 обычного веса).

По данным повторного исследования костного мозга (трипанобиопсия по окончании лечения), миелоидная ткань занимает до 60 объема межбалочных пространств. В островках миелоидной ткани соотношение числа клеток эритроидного и миелоидного ростков превышает норму. Имеются элементы нормобластоидной гиперплазии, в скоплениях нормобластов обнаруживаются группы клеток с признаками мегалобластоидности. Встречаются тучные клетки. Мегакариоциты представлены в значительном количестве. Объем запасов железа несколько увеличен.

Пример 11. Стимуляции эндогенной продукции цитокинов и лечебный эффект у больного раком желудка, осложненным канцероматозом брюшины, асцитом, спленомегалией и холестатическим гепатитом
Мужчина 33 лет наблюдается более двух лет по поводу неоплазмы желудка (аденокарцинома умеренной степени дифференцировки). В октябре 1993 года больной оперирован по поводу малигнизированной язвы желудка (плоскостная резекция). При операции обнаружен конгломерат плотных узлов в воротах печени, расцененный как метастазы.

В январе 1994 года на фоне проводимой химиотерапии (5FU) развилась тяжелая подпеченочная недостаточность, по поводу которой произведено чрезкожно-чрезпеченочно, наружно-внутреннее дренирование правого и левого печеночных протоков, а еще через 6 месяцев холедохоеюностомия на сменных транспеченочных дренажах с брауновским анастомозом. В ноябре 1995 года состояние ухудшилось. Клинически и по данным наблюдения у больного вторичный активный гепатит. Печень увеличена и болезненна, выступает из-под реберной дуги на 5 6 см. Биохимические показатели крови патологически изменены, слабо поддаются коррекции проводимым лечением: гипербилирубинемия до 40,0 за счет непрямого (до 31,0); повышение активности трансаминаз в 6 раз, гипоальбуминемия 26 гипергаммаглобулинемия; гиперхолестеринемия до 10,2 мкмоль/л.

При фиброгастродуоденоскопии (ноябрь 1995 г.) в средней трети тела желудка по большой кривизне экзофитнорастущая опухоль протяженностью 8 см. Опухоль плотная. Стенки желудка ригидные. Гистологически опухоль идентифицирована как аденокацинома умеренной степени дифференцировки. В декабре 1995 года больному произведена эксплоративная лапаратомия. Обнаружен асцит с множественными просовидными высыпаниями по брюшине. Пальпаторно определяется спленомегалия. Случай признан неоперабельным.

В связи с отсутствием адекватной терапии принято решение использовать лекарственную форму GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида. Препарат вводился системно (внутривенно и внутримышечно) и локально (обкалывание опухоли через эндоскоп в тех точках). Средняя доза для внутривенного и внутримышечного введения 0,1 0,5 мг/кг; при локальном введении до 50 мг местно. Парентеральное введение препарата 2 раза в сутки (утром внутривенно; вечером внутримышечные инъекции), через день, в течение трех недель; затем два раза в неделю в течение 4 недель. Обкалывание через эндоскоп один раз в семь дней.

Через 2 месяца после начала лечения по предлагаемому способу картина фиброгастродуоденоскопии: пищевод свободно проходим, слизистая розовая, розетка кардии смыкается не полностью. Натощак в желудке умеренное количество пенистого секрета интенсивно окрашенного желчью, желудок в области тела деформирован в форме "песочных часов", слизистая в зоне сужения тела инфильтрирована, плотная. Протяженность опухоли 5 см.

Одновременно наблюдается существенное улучшение гематологических, биохимических и иммунологических показателей.

Через 4 месяца лечения: печень выступает из под реберной дуги на 1 см; безболезненная при пальпации; по данным УЗИ на месте определяемых ранее очаговых изменений фиброзная ткань. Картина фиброгастродуоденоскопии (май 1996 г): пищевод не смыкается; в просвете желудка светлая мутная жидкость со слюной. Слизистая желудка розовая. В нижней трети на большой кривизне опухолевидное образование протяженностью 3,6 см с налетом фибрина. Стенки желудка эластичные. Двенадцатиперстная кишка свободно проходима.

По сравнению с обследованием до начала лечения (ноябрь 1995) определяется уменьшение размеров опухоли на 55 Одновременно отмечается убедительная положительная динамика печеночных проб, гематологических и иммунологических показателей (см. табл. 20).

Таким образом, в результате проведенного лечения по предлагаемому способу на фоне существенной стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов наблюдается частичный регресс опухолевого процесса, существенное повышение качества жизни и улучшение состояния основных физиологических функций организма.

Пример 12. Стимуляция эндогенной продукции цитокинов и лечебный эффект у больного нейро-эндокринным раком кожи (опухоль Меркеля) III стадии, осложненным гемоиммунодепрессией, вызванной химиотерапией.

Мужчина 64 лет наблюдается с августа 1995 года, когда появилось гиперемированное опухолевидное образование в левой окололопаточной области, безболезненное, постепенно увеличивающееся в размерах. По прошествии месяца процесс распространился на левую подмышечную область с ежедневным увеличением в размерах, стал болезненным. Появилась лихорадка (t 38,9^oC). Обследование (гистологическое и иммуногистохимическое), проведенное в октябре 1995 года, уточнило диагноз нейро-эндокринный рак кожи (опухоль Меркеля) III стадии.

В декабре 1995 года проведен курс химиотерапии по схеме CMF (циклофосфан + метотрексат + фторурацил) без заметного лечебного эффекта. В то же время отмечается токсическое действие на гемопоэз (лейкоциты 2,4·10⁹/л); рост среднешейных и надключичных лимфоузлов с гиперемией кожи.

В январе феврале 1996 года схема химиотерапии изменена: вместо CMF выполнен курс СР (цисплатин, циклофосфан).

На фоне проводимой химиотерапии осложнения: цитопения (лейкоцитов 1,4·10⁹/л), кардиотоксичность в виде обострения ишемической болезни сердца. После 2-го курса химиотерапии резкое прогрессирование опухоли: некроз в левой подмышечной области с образованием свища, нарастание инфильтрации мягких тканей в области левого плечевого сустава и левой подмышечной области: отек левой руки (лимфостаз); интоксикация, стойкое повышение температуры до 38,8^oC. В связи с прогрессированием заболевания и отсутствием эффекта цитостатической терапии принято решение о проведении терапии лекарственной формой GSSG в 0,1 растворе цистамина (далее препарат), параллельно с курсом химиотерапии (схема CMF).

Через 10 ежедневных инъекций препарата (внутривенно и внутримышечно, в дозе на одно введение 0,1 0,5 мг/кг) отмечается улучшение качества жизни (хороший аппетит, подвижность), подсыхание изъязвленных участков, ликвидация гнойного отделяемого, рубцевание свища, уменьшение размеров опухоли на 30 нормализация температуры тела, ограничение зон гиперемии, улучшение гематологических показателей.

Проведены 3-й и 4-й курсы химиотерапии (схема CMF) с одновременным введением лекарственной формы GSSG в 0,1 растворе цистамина: внутривенные и внутримышечные инъекции два раза в сутки в дозе 0,5 мг/кг внутривенно и 0,2 мг/кг внутримышечно. Парентеральное введение препарата 3 раза в неделю по схеме и один раз в неделю локальное обкалывание очага поражения в двух точках: по 30 мг в каждую точку. На фоне указанной сочетанной терапии отмечается регресс опухолевого процесса, отличная переносимость химиотерапии, в том числе отсутствие болевого синдрома, постоянное улучшение качества жизни, реставрация иммунитета и системы кроветворения, повышение содержания в крови цитокинов и гемопоэтических факторов.

Через 2 месяца после лечения по предлагаемому способу имеет место стабильный уровень эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, регресс левых средне-шейных и надключичных лимфоузлов, регресс размеров опухоли по двум измерениям на 70 от исходных, положительная динамика иммунологических показателей (см. табл. 21), отсутствие угнетающего действия цитостатической терапии на кроветворение.

Проведенное клиническое наблюдение свидетельствует об очевидном лечебном эффекте предлагаемого способа, ибо на фоне существенной стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов выявлено уменьшение размеров опухоли, повышение качества жизни и показателей основных функций организма.

Формула изобретения

1. Применение глутатиона окисленного, представляющего собой димер глутатиона восстановленного трипептида со структурой γ -глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с указанной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками, в качестве стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов.

2. Средство для лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый компонент, отличающееся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество глутатиона окисленного.

3. Средство по п.2, отличающееся тем, что оно представляет собой инъекционный раствор глутатиона окисленного в фармацевтически приемлемом растворителе в концентрации 0,01 2,0%
4. Средство по пп.2 и 3, отличающееся тем, что для усиления и продления лечебного эффекта оно содержит фармацевтически приемлемый компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме.

5. Способ по п.4, отличающееся тем, что оно представляет собой инъекционный раствор глутатиона окисленного в составе 0,003%-ного раствора перекиси водорода.

6. Способ потенцирования эффектов глутатиона окисленного стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, заключающийся в том, что окисленный глутатион используют в составе фармацевтической композиции, содержащей компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме.

7. Способ лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, включающий парентеральное введение лекарственной формы фармакологического средства по пп.3 и 4 в дозах 0,01 0,5 мг глутатиона окисленного на 1 кг массы тела, путем выполнения одного или более дней или непрерывно до момента достижения лечебного эффекта.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): ФГУП Московский эндокринный завод

Номер и год публикации бюллетеня: 4-2004

(73) Новый патентообладатель:
ЗАО "ФАРМА ВАМ"

Договор № 17533 зарегистрирован 16.10.2003

Извещение опубликовано: 10.02.2004        

* ИЛ - исключительная лицензия        НИЛ - неисключительная лицензия

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.12.2003

Извещение опубликовано: 10.11.2004        БИ: 31/2004

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.12.2005

Извещение опубликовано: 20.03.2007        БИ: 08/2007

QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Закрытое акционерное общество "ВАМ"

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМА ВАМ Санкт-Петербург"

Характер внесенных изменений (дополнений):
Расторжение по взаимному согласию сторон.

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения:
06.03.2001 № 12066

Извещение опубликовано: 10.06.2007        БИ: 16/2007

* ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия

PC4A Государственная регистрация договора об отчуждении исключительного права

Дата и номер государственной регистрации договора: 20.03.2012 № РД0096291

Лицо(а), передающее(ие) исключительное право:
Закрытое акционерное общество "ВАМ" (RU)

Приобретатель исключительного права: Закрытое акционерное общество "Ива-фарм" (RU)

(73) Патентообладатель(и):
Закрытое акционерное общество "Ива-фарм" (RU)

Адрес для переписки:
"АРС-ПАТЕНТ", Липатовой И.И., а/я 230, Санкт-Петербург, 191186

Дата внесения записи в Государственный реестр: 20.03.2012

Дата публикации: 27.04.2012

---