Пептид, проявляющий свойства антагониста тиролиберина

 

Назначение: медицина, как соединение, проявляющее свойства антагониста тиролибарина. Сущность изобретения: амид альфа-пироглутамил -L-арил-L-норлейцина, С₁₄H₂₄N₄O₅, т. пл. 225-227^oC. [α]²_D² = -40,5 (C = 1,0, 50% CH₃COOH. Соединения получено путем взаимодействия метилового эфира L-пироглутамил-L-серина с L-норлейцинамидом в диметилформамиде в присутствии триэтиламина, причем реакционную смесь выдерживают 30 мим при -20^oC, 1 час при О^oС и 18 час при 40^oС. Выход прибл. 30 проц. 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к новому биологически активному пептиду, тормозящему гиперсекрецию тиреотропного гормона (ТТГ) и пролактина (ПРЛ), вызываемую природным гипоталамичeским пептидом тиролиберином (тиреотропин-рилизинг-гормоном, ТРГ). Новый пептид, являющийся антагонистом тиролиберина, (1-3) может найти применение в медицине.

Цель изобретения нахождение в ряду структурных аналогов ТРГ пептидного антагониста тиролиберина, не проявляющего токсичности и не вызывающего побочных эффектов. Указанная цель достигается новым пептидом формулы (I) , L·Pyr остаток L-пироглутаминовой кислоты; L·Ser остаток L-серина; L·Nle остаток L-норлейцина.

Структурные различия между новым пептидом (I) и тиролиберином (II) показывает сравнение соответствующих структурных формул: Новый пептид получен путем химического синтеза по схеме, приведенной на чертеже.

Стадии синтеза отражены в следующих примерах. Пример 1. Синтез метилового эфира L-пироглутамил-L-серина (V).

К раствору 4,67 г (30 ммоль) гидрохлорида метилового эфира L-серина (IV) в 30 мл диметилформамида (ДМФА) прибавляют при О^oС 4,17 мл (30 ммоль) триэтиламина и 11,44 г (33 ммоль) пентахлорфенилового эфира L-пироглутаминовой кислоты (III). Реакционную смесь выдерживают 18 ч при 20^oС, затем фильтруют и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в воде и полученный водный раствор экстрагируют этилацетатом. После экстракции водный раствор упаривают в вакууме и остаток перекристаллизовывают из этанола.

Получают 5,4 г (78%) соединения (V). Т.пл. 177-178^oC, [α]²_D⁰-21^o (с 1,0; CH₃OH); R_f 0,30 (н.-C₄H₉OH-CH₃CO₂H-H₂O, 4:1:1) (система 1), 0,20 (CHCl₃-CH₃OH, 9:1) (система 2) (ТСХ на пластинках Silufol UV-254).

Найдено, C 46,85; H 6,16; N 12,27.

C₉H₁₄N₂O₅. Вычислено, C47,00; H 6,12; N 12,15.

Пример 2. Синтез гидразида L-пироглутамил-L- серина (VI).

К суспензии 3,32 г (14,4 ммоль) соединения (V) в 48 мл метанола прибавляют при О^oС по каплям 3,7 мл (74 ммоль) гидразингидрата. Реакционную смесь выдерживают 12 ч при 4^oС и еще 48 ч при 20^oС. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывают, промывают метанолом и перекристаллизовывают из смеси метанола с водой (4:1).

Получают 2,72 г (82%) соединения (VI). Т. пл. 212-214^oС (с разл.); [α]²_D² -40^o (c1,0; H₂O); R_f 0,27 (н.-С₄Н₉ОН-C₅H₅N-CH₃CO₂H-H₂O, 15:10:3:12) (система 3), 0,25 (C₆H₆- -СH₃ОН, 9:1) (система 4), 0,56 (СНCl₃-СН₃)OН- 25% NН₄ОН, 12: 9:4) (система 5).

Найдено, С 41,55; Н 6,25; N 24,73.

С₈Н₁₄N₄0₄ Вычислено, С 41,65; Н 6,13; N 24,57.

Пример 3. Синтез амида L-пироглутамил-L-серил -L-норлейцина (I).

Растворяют 690 мг (3 ммоль) соединения (I) при О^oС в смеси 18 мл ДМФА и 3 мл 10н. раствора хлористого водорода в тетрагидрофуране (ТГФ), охлаждают полученный раствор до -20^oС и к нему прибавляют по каплям при перемешивании 0,58 мл (4,3 ммоль) амилнитрита. Смесь перемешивают 30 мин, охлаждают до -25^oС и прибавляют к ней по каплям 0,42 мл (3 ммоль) триэтиламина и охлажденный раствор 390 мг (3 ммоль) L-норлейцинамида (VII) в 3 мл ДМФА. Реакционную смесь выдерживают 30 мин при -20^oС, 1 ч при О^oС и 18 ч при 4^oС. Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме и остаток дважды перекристаллизовывают из этанола.

Получают 509 мг (52%) соединения (I) в форме полугидрата. Т.пл. 225 - 227^o [α]²_D² -40,5^o (с 1,0; 50% CH₃CO₂H; R_f 0,40 (CHCl₃-СH₃ОH- 25% NН₄ОН, 12: 6;1) (система 6).

Найдено, С 49,81; Н 7,37; N 16,65.

С₁₄Н₂₄N₄0₅·1/2H₂O Вычислено, С 49,83; Н 7,47; N 16,60.

Пример 4. Биологические испытания.

Проводят биологические испытания пептида (I). Испытания по влиянию соединения (I) на секрецию тиреотропного гормона (ТТГ) и пролактина (ПРЛ)in vitro проводят на 5-дневных культурах клеток аденогипофизов крыс (самки линии Вистар, масса 150-200 г). Концентрации ТТГ и ПРЛ в инкубационной среде определяют посредством гомологичного радиоиммуноанализа с применением очищенных препаратов ТТГ и ПРЛ крысы и высокоспецифичных сывороток (4). Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стъюдента. Результаты испытаний приведены в табл. 1 и 2.

Как видно из табл. 1, пептид (I) в концентрации 100 кг/мл не влияет на базальную секрецию ТРГ и ПРЛ. В то же время пептид (I) вызывает статистически достоверное торможение стимулирующего влияния ТРГ на секрецию ТТГ и ПРЛ.

Как видно из табл.2, внутривенное введение пептида (I) не изменяет концентрацию ПРЛ в сыворотке крови, в то время как введение ТРГ резко увеличивает ее.

Введение пептида (I) как за 10 мин до введения ТРГ, так и одновременно с ним, полностью устраняет стимулирующее действие последнего на секрецию ПРЛ.

Таким образом, новый пептид (I) является антагонистом тиролиберина.

В серии специально проведенных опытов in vivo на крысах установлено, что пептид (I) при внутривенном введении крысам в дозе 1000 мкг/кг не обнаруживает токсичности и не вызывает ухудшения общего состояния животных. Не обнаружено также никаких морфологических изменений в структуре клеток при проведении испытаний пептида (I) на культурах клеток.

Таким образом, синтезирован новый пептид формулы (I), являющийся антагонистом тиролиберина, не проявляющий токсичности и не вызывающий побочных эффектов.

Формула изобретения

Пептид формулы L-Pyr-L-Ser-L-Nle-NH₂, проявляющий свойства антагониста тиролиберина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3